不同發(fā)育期大通牦牛心肌、骨骼肌線粒體ATP 酶活性的測定

張貴勝，李 莉，常建軍，魏 青，張勤文

（1.青海省大通種牛場，青海大通810102；2.青海大學農牧學院，青海西寧810016）

大通牦牛是在青藏高原自然生態(tài)條件下，通過引入野牦牛血液培育的牦牛新品種，在同等飼養(yǎng)管理條件下，改良后代牦犢牛生長發(fā)育快，具有明顯的個體優(yōu)勢，因其育成于青海省大通種牛場而得名。線粒體是真核生物細胞內的一種重要而獨特的細胞器，是氧化磷酸化和形成三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的主要場所，動物體新陳代謝所需的能量主要由細胞內的三磷酸腺苷直接提供，三磷酸腺苷水解釋放的能量是生物體維持細胞分裂、肌肉收縮、腺體分泌、神經傳導等生命活動所需能量的直接來源，所以ATP可以反映生物體新陳代謝的狀況。有關牦牛低氧適應的相關機制已有一些報道，但牦牛肌組織線粒體生物學特性與低氧適應性的關系報道甚少。本試驗以同一海拔地區(qū)四個年齡段大通牦牛作為研究對象，通過測定牦牛骨骼肌、心肌線粒體中Na＋－K＋－ATP、Ca2＋－Mg2＋－ATP、Ca2＋－ATP 和 Mg2＋－ATP 4種酶的活性，從發(fā)育學角度為研究大通牦牛高原低氧適應性提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用動物 青海省大通種牛場（海拔3 300 m左右）牦牛，按照出生年齡分為1、30、180日齡和成年組，共4組，每組各5頭。

1.1.2 儀器及試劑 UV－1601紫外線分光光度計（SHIMADZU公司）；電子天平（瑞士產 AB204－E）；普通離心機（北京醫(yī)用離心機廠LD4－2）；低溫高速離心機（上海安亭）；超聲波；恒溫水浴鍋（KS648）。ATP酶；考馬斯亮藍測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集與處理

1.2.1.1 組織的采集與處理 將牦牛屠宰后迅速取其心肌和骨骼肌組織，超低溫保存，制備組織勻漿，提取線粒體，用于牦牛線粒體ATP酶活性的測定。

1.2.1.2 組織勻漿的制備和線粒體的提取 取出樣本自然解凍后，在4℃的生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙拭干，稱取1.0 g于研缽中，加入4℃生理鹽水9 mL，用眼科小剪盡快剪碎組織，制備成100 g／L的組織勻漿，取100 g／L的組織勻漿用普通離心機以1 000 r／min～2 000 r／min，離心10 min，棄沉淀，取上清液以8 000 r／min～10 000 r／min（低溫高速離心機離心）15 min，沉淀物為線粒體（線粒體的提取由南京建成生物工程研究所提供，中性紅－詹納斯綠B染色鑒定線粒體），將分離的線粒體用冰冷的勻漿介質制備成混懸液，用超聲波細胞破碎儀將其破碎，供線粒體中ATP酶活性的測定。

1.2.2 測定方法

1.2.2.1 總蛋白的測定 按南京建成生物工程研究所提供的考馬斯亮蘭蛋白試劑盒測定心肌、骨骼肌線粒體提取液中蛋白質的含量，線粒體蛋白質的含量用于計算線粒體4種ATP酶的活性。

1.2.2.2 ATP酶的測定 按南京建成生物工程研究所提供的ATP酶試劑盒操作步驟測定心肌、骨骼肌線粒 體 提 取 液 中 Na＋－K＋－ATP、Ca2＋－Mg2＋－ATP、Ca2＋－ATP 和 Mg2＋－ATP 4種酶的活力，以每小時每毫克蛋白分解ATP產生1μmol無機磷的量為1個ATP酶活力單位來計算，即為μmolPi／mgprot／h。

三磷酸腺苷酶計算公式：

“＊”表示反應時間10 min，乘以6為1 h，“＊＊”表示蛋白單位mg／mL。

1.2.3 數據處理 所有數據采用SAS（6.12版）軟件GLM過程進行方差分析及Duncan’s進行多重比較，檢驗誤差為5%。

2 結果

不同發(fā)育期大通牦牛心肌線粒體ATP酶活性參數值見表1，心肌線粒體 Na＋－K＋－ATP、Mg2＋－ATP、Ca2＋－ATP和Ca2＋－Mg2＋－ATP 4種酶活性在年齡組間差異均不顯著（P＞0.05）。

不同發(fā)育期大通牦牛骨骼肌線粒體ATP酶活性參數值見表2。骨骼肌線粒體 Na＋－K＋ATP、Mg2＋－ATP、Ca2＋－ATP和 Ca2＋－Mg2＋ATP 4種酶活性在年齡組間差異均不顯著（P＞0.05）。

表1 不同發(fā)育期大通牦牛心肌線粒體ATP酶活性參數值（ˉx±SD）Table1 The determination of cardiac mitochondrial atpase activity in various ages of yaks（ˉx±SD） μmol／mg

表2 不同發(fā)育期大通牦牛骨骼肌線粒體ATP活性參數值（ˉx±SD）Table2 The determination of skeletal muscle mitochondrial atpase activity in various ages of yaks（ˉx±SD） μmol／mg

3 討論

3.1 牦牛肌線粒體ATP酶活性與相關離子代謝平衡的關系

線粒體 ATP酶主要包括 Na＋－K＋－ATP、Ca2＋－Mg2＋－ATP、Ca2＋－ATP 和 Mg2＋－ATP 4 種 酶。Na＋－K＋－ATP酶和 Ca2＋－ATP酶對動物滲透壓的調節(jié)、細胞內外離子平衡、膜興奮傳導、物質運輸及能量代謝等方面起著重要作用。肌細胞膜上的Na＋－K＋－ATP酶是維持肌纖維結構和功能的重要蛋白，是細胞能量轉換的重要系統(tǒng)，對保持細胞體積及p H、肌肉和神經細胞的細胞膜興奮性、腎臟中Na＋和水的重吸收等生理過程具有重要作用［1］。Ca2＋－Mg2＋－ATP酶主要分布在骨骼肌和心肌的肌漿網上，激活時可將胞漿中的Ca2＋迅速集聚到肌漿網內部，使胞漿中Ca2＋濃度在短期內下降到原來的1／100，這是誘發(fā)肌肉舒張的關鍵因素。由于肌漿網內Ca2＋貯存量增加，還能增加肌肉收縮時肌漿網釋放更多的Ca2＋，從而加強肌肉的收縮能力［2］。本試驗的大通牦牛心肌和骨骼肌線粒體Na＋－K＋ATP，Mg2＋－ATP，Ca2＋－ATP，Ca2＋－Mg2＋ATP 4種酶活性在年齡組間差異均不顯著（P＞0.05），表明大通牦牛在生長發(fā)育階段能有效的保持Na＋－K＋離子和Ca2＋－Mg2＋離子的代謝平衡。

3.2 牦牛心肌、骨骼肌運動能力與ATP酶活性的關系

ATP酶存在于組織細胞膜及細胞器的膜上，在物質運送、能量轉換以及信息傳遞方面具有重要的作用，因而，ATP酶活性是影響肌肉收縮張力和收縮速率的重要因素。機體在缺氧或病理狀態(tài)下，ATP酶活力發(fā)生一系列轉變，所以ATP酶活力的大小是評價各種細胞能量代謝及功能有無損傷的重要指標。有研究表明，急性缺氧使線粒體氧化磷酸化功能受損，ATP生成減少和ATP酶活性顯著降低［3］。李彤等［4］通過低氧運動對大鼠心肌閏盤及其線粒體ATP的作用研究，結果顯示，在急性低氧運動Na＋，Ca2＋－ATPase顯著下降，經過4周低氧訓練適應后，心肌線粒體ATP酶活性上升。夏前明等［5］報道對當腦缺血、缺氧時，ATP生成減少，細跑能量代謝障礙，Na＋－K＋－ATP酶活性降低，細胞內Na＋濃度升高，Na＋－Ca2＋交換增強，引起細胞內鈣超載，最終導致細胞發(fā)生不可逆的損傷。運動中乳酸增加，p H下降，細胞內Ca2＋濃度增加，胞內K＋的持續(xù)丟失，胞外Na＋的內流，細胞膜上ATP酶含量的減少等因素都可能會降低Na＋－K＋－ATP酶的活性和數量表達［6］。本試驗結果表明，在同一海拔地區(qū)，大通牦牛心肌、骨骼肌線粒體ATP酶在物質運輸、能量轉換及信息傳遞等方面發(fā)揮著穩(wěn)定的作用。

3.3 牦牛心肌、骨骼肌線粒體ATP酶與年齡的關系

研究已證實，在骨骼肌中 Na＋－K＋－ATP酶主要分布在肌細胞膜，而且不同物種、不同年齡、不同類型肌纖維的細胞膜上Na＋－K＋－ATP酶的濃度不同［7］。有研究報道，4周齡的老鼠比目魚肌細胞膜上 Na＋－K＋－泵的濃度約3 350 mol／μm2，同樣年齡的蛙比目魚肌細胞膜上 Na＋－K＋－泵的濃度約2 500 mol／μm2［8］。Suwannachot P 等［9］對5 歲至成年馬的研究發(fā)現，隨著年齡的增大，同一骨骼肌細胞膜上Na＋－K＋－泵的數量也隨著增加。在豬的同一骨骼肌細胞膜上Na＋－K＋－泵數量的變化與年齡沒有線性關系［10］。Kjeldsen K 等［11］對不同年齡的人體股外側肌細胞膜上Na＋－K＋－泵的數量進行檢測，發(fā)現Na＋－K＋泵數量與年齡之間也沒有明顯的關系。本試驗選擇的動物是牦牛新品種，具有穩(wěn)定的遺傳性、較高的產肉性能、優(yōu)良的抗逆性及對高山高寒草場的利用性強等特點。從4個年齡組的測定數據顯示，大通牦牛心肌、骨骼肌線粒體ATP酶的代謝水平與其年齡之間無明顯的線性關系。

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