嗜熱鏈球菌的分離鑒定及牛乳樣中抗菌藥物殘留的檢測

李增魁，黃文明，卓 瑪

（1.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海西寧810016；2.青海省同德縣動物疫病預(yù)防控制中心，青海同德813200；3.青海省同德縣巴溝鄉(xiāng)獸醫(yī)站，青海同德813200）

嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus，ST）屬于異常球菌科鏈球菌屬的革蘭陽性菌，在伯杰細(xì)菌鑒定手冊中分成六類，其自然棲息地不詳，但在熱及低溫殺菌的乳制品中能發(fā)現(xiàn)該菌的存在［1］。該菌無致病力，在人體內(nèi)能夠耐受胃酸和膽鹽，并且可抑制腸道致病菌，又能產(chǎn)生胞外多糖、細(xì)菌素和維生素等活性物質(zhì)，被認(rèn)為是一種多功能益生菌，常作為制造乳制品的重要原料。因此，嗜熱鏈球菌在乳制品工業(yè)中扮演著非常重要的角色。嗜熱鏈球菌在37℃環(huán)境下生長良好，耐高溫，在60℃下可存活，能在45℃乳中快速生長，籍此特性可與同屬其他細(xì)菌相鑒別［2］。從生化特性上來看，嗜熱鏈球菌發(fā)酵乳糖、蔗糖，也能發(fā)酵果糖、甘露糖、葡萄糖及乳糖使其產(chǎn)酸。

當(dāng)前，全世界細(xì)菌耐藥性已伴隨著抗生素的廣泛使用而越來越嚴(yán)重，除了致病菌的耐藥問題，益生菌菌株和抗生素同時服用時，雖能幫助宿主恢復(fù)腸道菌群平衡［3］，使益生菌在腸道存活，但人和動物體內(nèi)的益生菌一旦產(chǎn)生耐藥性后，其耐藥基因有可能在腸道內(nèi)菌群之間相互傳遞［4］，從而導(dǎo)致某些致病菌也獲得耐藥性。因此，益生菌的安全性應(yīng)受到更多的關(guān)注。

由于抗生素殘留的危害［5］，我國規(guī)定按國家標(biāo)準(zhǔn)［6］生產(chǎn)的鮮牛乳中不得檢出抗生素［7］。嗜熱鏈球菌因在牛乳中生長時可將無色的2，3，5－氯化三苯基四氮唑（2，3，5－triphenyltetrazolium chloride，TTC）還原為紅色的三苯甲瓚而作為指示菌，如果嗜熱鏈球菌產(chǎn)生耐藥性，則會對牛乳中抗生素殘留的檢測結(jié)果產(chǎn)生影響。因此，從乳制品中分離嗜熱鏈球菌，對其耐藥性進(jìn)行了測定，再用分離到的嗜熱鏈球菌作為指示菌對牛乳中抗生素的殘留進(jìn)行了檢測，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 檢樣與藥品 純牛奶，購自西寧不同品牌、不同包裝的純牛奶13份（編號為No.1～13）和散裝奶44份（編號為No.14～57）作為檢測樣品；嗜熱乳酸鏈球菌分離于某品牌酸奶；TTC（2，3，5－氯化三苯四氮唑）購于北京經(jīng)科宏達(dá)生物技術(shù)有限公司；注射用青霉素鈉，提供生產(chǎn)商。

1.1.2 試驗菌株 嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus，ST）由市售某品牌酸奶中分離。

1.1.3 培養(yǎng)基 BCG牛乳培養(yǎng)基、乳酸菌葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基、牛乳培養(yǎng)基、MH培養(yǎng)基等。

1.1.3.1 BCG 牛乳培養(yǎng)基 A 溶液：脫脂乳粉20g，水100mL，加入16g／L溴甲酚紫乙醇溶液0.2mL，80℃滅菌20min；B溶液：酵母膏2g，水100mL，瓊脂4g，121℃濕熱滅菌20min。以無菌操作趁熱將A、B溶液混合均勻后倒入8個平板。

1.1.3.2 乳酸菌葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基 蛋白胨0.5g，牛 肉 膏 0.5g，酵 母 膏 0.5g，吐 溫－80 0.05mL，葡萄糖1g，蒸餾水100mL，加入16g／L溴甲酚紫溶液約0.14mL。以上成分溶解后調(diào)pH到6.8～7.0，分裝到10只試管中。每只試管里再放置一支德拉姆氏小管。105℃濕熱滅菌15min。

1.1.3.3 牛乳培養(yǎng)基 12g全脂奶粉，加水100mL，加入10g葡萄糖，溶解后分裝，105℃滅菌15min，取出備用。

1.1.3.4 MH培養(yǎng)基 MH培養(yǎng)購于杭州天和微生物有限責(zé)任公司，稱取42.0g成品培養(yǎng)基溶解于1 000mL蒸餾水中，倒入錐形瓶中加蓋，121℃濕熱滅菌20min。

1.1.4 藥敏紙片 28種藥敏紙片（批號為ws／T125－1999），購于杭州天和微生物試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理及嗜熱鏈球菌的分離

1.2.1.1 樣品處理 取酸奶10mL加入90mL無菌生理鹽水，充分混勻。從三角瓶吸取1mL菌液，加入9mL無菌生理鹽水試管中。依次倍比稀釋。

1.2.1.2 培養(yǎng) 將新鮮酸奶采用稀釋平板涂布于BCG牛乳培養(yǎng)基平板上，稀釋菌液置于冰箱中備用，平板置于培養(yǎng)箱37℃±1℃中培養(yǎng)2d～3d。

1.2.1.3 分離純化 挑取單菌落，用劃線法于BCG牛乳培養(yǎng)基分離純化，置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.2 嗜熱鏈球菌的鑒定

1.2.2.1 菌種的革蘭染色和形態(tài)觀察 將分離的純菌種接種在BCG牛乳培養(yǎng)基上，40℃培養(yǎng)28h，用無菌接種環(huán)取一環(huán)菌均勻涂布在滴有無菌水的載玻片上，自然風(fēng)干。固定后進(jìn)行革蘭染色。染色后用顯微鏡油鏡進(jìn)行觀察。

1.2.2.2 生化鑒定 分別取可疑菌落接種到葡萄糖、木糖、七葉苷、側(cè)金盞花醇、棉籽糖、甘露糖、纖維二糖、β－半乳糖苷、山梨醇、明膠、阿拉伯糖、乳糖的發(fā)酵試管中，并將其置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后觀察。

1.2.3 嗜熱鏈球菌的益生性

1.2.3.1 耐熱性試驗 將純化菌株接入糖發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)并觀察其顏色變化。將純化菌株接入BCG培養(yǎng)基中，分別在15℃和45℃恒溫培養(yǎng)2d～3d，觀察菌株生長情況。將奶粉配成濃度120g／L的溶液，分裝試管，80℃殺菌30min，冷卻接入純化菌株，37℃恒溫培養(yǎng)并觀察其凝乳情況。

1.2.3.2 牛奶發(fā)酵試驗 將分離的純菌種活化后，以2%的接種量接入牛乳培養(yǎng)基中，搖勻后，將瓶蓋擰緊密封。將三角瓶置于40℃恒溫箱中培養(yǎng)，出現(xiàn)凝固后轉(zhuǎn)入4℃冰箱中冷藏24h。

1.2.4 藥敏試驗 吸取1mL濃度為1×108cfu／mL的菌懸液于15mL MH培養(yǎng)基（40℃～50℃）中，混和均勻后傾注到平皿中，待瓊脂表面凝固后取藥敏紙片貼于瓊脂表面，每個培養(yǎng)皿貼4張間隔均勻適中的同種藥物紙片，靜置5min后翻轉(zhuǎn)平皿，于37℃恒溫培養(yǎng)，48h后測量并記錄抑菌圈的直徑。

1.2.5 抗生素殘留的檢測方法

1.2.5.1 樣品檢測 取待檢樣液9mL，在80℃水浴加熱5min后冷卻到37℃以下，加活菌液1mL，在36℃±1℃水浴2h，加入4%的TTC指示劑0.3mL，36℃±1℃ 水浴培養(yǎng)30min。

1.2.5.2 試驗結(jié)果判斷 被檢牛乳中如果有抗生素殘留，則加入的嗜熱鏈球菌被抑制，因此，氯化三苯基四氮唑被還原，所以不顯色，結(jié)果呈陽性。相反，被檢牛乳中如果沒有抗生素殘留，加入的嗜熱鏈球菌則進(jìn)行增殖，氯化三苯基四氮唑被還原而顯紅色，結(jié)果呈陰性。

1.2.5.3 試驗結(jié)果觀察 如為陽性，再水浴培養(yǎng)30min做第2次觀察。每份檢樣做2份，另外再做陰性、陽性對照各1份，陽性對照管用無抗生素的乳8mL加抗生素及菌液和TTC。陰性對照管用無抗生素乳9mL加菌液和TTC。

2 結(jié)果

2.1 嗜熱鏈球菌的分離與純化的結(jié)果

稀釋酸奶并涂布于BCG牛乳培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)48h后，觀察到黃色、扁平、邊緣不整齊的菌落。

2.2 分離菌的革蘭染色及形態(tài)觀察

分離菌革蘭染色呈藍(lán)紫色，菌體呈球形或卵圓形的球菌，排列成長短不等的鏈狀。

2.3 生化鑒定結(jié)果

葡萄糖、七葉苷、乳糖、甘露醇、明膠產(chǎn)酸變色，鑒定為陽性，阿拉伯糖、β－半乳糖苷、棉籽糖、纖維二糖、山梨醇、側(cè)金盞花醇為陰性。通過與《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》和《乳酸細(xì)菌的分類鑒定與實驗方法》對照，可鑒定其為嗜熱乳酸鏈球菌（表1）。

2.4 耐熱性試驗結(jié)果

分離菌接種于BCG牛乳培養(yǎng)基上，分別在15℃、45℃的環(huán)境中培養(yǎng)，均可觀察到菌落的生長。

2.5 分離菌株的牛奶發(fā)酵結(jié)果

將分離菌株活化后接入滅菌的牛乳培養(yǎng)基中進(jìn)行了牛奶發(fā)酵，酸奶的組織狀態(tài)細(xì)膩；4.6h凝乳且均勻，有少量乳清析出；品嘗無異味，脂香味濃；pH 5.2。

2.6 藥敏試驗結(jié)果

因國內(nèi)還沒有提供針對非致病乳酸細(xì)菌的藥敏標(biāo)準(zhǔn)［8］，所以我們列出了分離到的嗜熱鏈球菌對28種抗生素在MH培養(yǎng)基上的抑菌圈直徑，供其他研究者參考。分離菌對氨芐西林（AMP）的抑菌圈直徑為0mm，即耐藥；分離菌對青霉素G（PV）、紅霉素（ERY）的抑菌圈小，分別為8mm、9mm（表2）。

2.7 抗菌藥物殘留檢測結(jié)果

從表3可以看出，抽檢某品牌牛乳13份，檢出抗菌藥物殘留陽性乳樣7份，陽性率53.8%，可疑乳樣1份，可疑率7.69%；抽檢散裝乳44份，檢出抗生素殘留陽性乳樣5份，陽性率11.36%，可疑乳樣1份，可疑率2.27%。抽檢乳樣抗生素殘留總陽性率為21.05%，可疑率為3.51%。

表1 試驗菌株的生化試驗結(jié)果Table 1 The results of the biochemistry test of the isolated bacteria

表2 分離細(xì)菌藥敏試驗結(jié)果Table 2 The drug susceptibility tests of the isolated bacteria

表3 不同牛乳樣的抗菌藥物殘留檢測結(jié)果Table 3 The drug residue results of 57different milk samples detected by TTC method

3 討論

BCG牛乳培養(yǎng)基中因有指示劑溴甲酚紫，有嗜熱鏈球菌生長時菌落顏色為黃色，加之嗜熱鏈球菌在45℃依然生長，易與其他菌鑒別。革蘭染色、形態(tài)觀察可對分離到的菌株進(jìn)行簡單鑒定。但在對嗜熱鏈球菌菌株因培養(yǎng)時間的長短、培養(yǎng)溫度的波動、培養(yǎng)基的厚薄，其菌落形態(tài)有所差異。因此，生化鑒定雖難達(dá)到菌株水平的鑒定要求［1］，但它是鑒定微生物的常用方法。

目前國內(nèi)藥敏試驗結(jié)果的判定沒有提供針對非致病乳酸細(xì)菌的藥敏標(biāo)準(zhǔn)［8］。有學(xué)者認(rèn)為乳酸菌幾乎不能在MH（NCCLS推薦）培養(yǎng)基上生長［9］。但在本次試驗中采用傾注接種法，嗜熱鏈球菌在MH培養(yǎng)基中生長良好，形成的抑菌圈清晰，可得到滿意藥敏試驗結(jié)果；培養(yǎng)時間的長短也對抑菌圈直徑影響不大。

從這次的藥物敏感試驗結(jié)果來看，嗜熱鏈球菌對絕大部分抗生素都敏感，卻對氨芐西林（AMP）耐藥（抑菌圈直徑為0mm）。用本次分離的嗜熱鏈球菌作為指示菌用于TTC法檢測牛乳中抗生素的殘留，如果牛乳中殘留有β－內(nèi)酰胺類抗生素，則有可能無法檢出。鑒于TTC法的缺陷和不足，需要開發(fā)更為快速、靈敏、準(zhǔn)確的抗生素殘留分析方法。

本次試驗對西寧地區(qū)牛乳中的抗生素殘留調(diào)查只采用了TTC法，對具體的殘留品種及殘留量沒有檢測，但僅從21.05%（12／57）的陽性率來看，與“無公害食品標(biāo)準(zhǔn)的抗生素殘留不得檢出”的要求還有很大差距。要解決牛乳安全的問題，應(yīng)從源頭上來控制抗生素的殘留［10］。

［1］ 布坎南R E，吉本期N E.伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊［M］.8版.北京：科學(xué)技術(shù)出版社，1984.

［2］ Bernard W H，F(xiàn)rederick J B.Dairy bacteriology［M］.4th edition.New York：John Wiley and Sons Inc，1984.

［3］ Madden J A J，Plummer S F，Tang J，et al.Effect of probiotics on preventing disruption of the intestinal microflora following antibiotic therapy：a double－blind，placebo－controlled pilot study［J］.Int Immunopharmacol，2005，5（6）：1091－1097.

［4］ Saarela M，Mogensen G，F(xiàn)onden R，et al.Probiotic bacteria：safety，functional and technological properties［J］.J Biotechnol，2000，84：197－215.

［5］ 陳懷宇，黃周英，林育騰.牛乳中抗生素的殘留與危害現(xiàn)狀［J］.泉州師范學(xué)院學(xué)報，2004，22（6）：102－106.

［6］ 食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗·鮮乳中抗生素殘留量檢驗［S］.中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)，GB／T 4789.27－2003.

［7］ 無公害食品 生鮮牛乳［S］.中華人民共和國農(nóng)業(yè)部行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，NY 5045－2008.

［8］ Masco L，Van Hoorde K，De Brandt E，et al.Antimicrobial susceptibility of Bifidobacteriumstrains from humans，animals and probiotic products［J］.J Antimicrob Chemother，2006，58（1）：85－94.

［9］ 馮大偉，周家春.益生乳酸菌的紙片擴(kuò)散法藥敏性試驗評價［J］.微生物學(xué)通報，2010，37（3）：454－464.

［10］ 高世濤，宋衛(wèi)東.加強(qiáng)奶源管理正確使用有效檢測實現(xiàn)牛奶抗生素殘留達(dá)到安全極限［J］.中國乳業(yè)，2002，（11）：12－14.