豬附紅細(xì)胞體對(duì)自然感染長(zhǎng)白仔豬血液學(xué)指標(biāo)的影響

楊朋艷，梁晚?xiàng)?，張守發(fā)，賈立軍

（延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，吉林延吉133002）

附紅細(xì)胞體病（Eperythrozoonosis）簡(jiǎn)稱附紅體病，是由附紅細(xì)胞體（Eperythrozoon）感染機(jī)體后，附著于人和動(dòng)物紅細(xì)胞表面或游離于血漿及骨髓中所引起的人獸共患的傳染性疾病。該病多為隱性感染，急性發(fā)病時(shí)以發(fā)熱、貧血和黃疸為主要臨床表現(xiàn)。我國是目前該病流行最為嚴(yán)重的國家之一，相繼報(bào)道本病流行的省、市、自治區(qū)已有20多個(gè)［1］。該病不僅導(dǎo)致畜產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量降低，動(dòng)物生育能力下降，而且還可導(dǎo)致動(dòng)物出現(xiàn)嚴(yán)重的臨床癥狀，甚至死亡［2］，已經(jīng)對(duì)畜牧業(yè)發(fā)展及人類健康構(gòu)成了嚴(yán)重威脅，是一種亟待控制的傳染?。?］。本研究對(duì)自然感染豬附紅細(xì)胞體長(zhǎng)白仔豬進(jìn)行了血液學(xué)指標(biāo)和血清生化指標(biāo)的測(cè)定，以期為該病的臨床診斷和防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本 采自延邊某豬場(chǎng)，35日齡左右的長(zhǎng)白仔豬20頭。

1.1.2 試劑 r Taq DNA 聚合酶、DNA Marker、DNA提取試劑盒等均為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 病原體鑒定

1.2.1.1 姬姆薩染色 頸靜脈無菌采集仔豬血液抗凝劑抗凝，滴1滴于潔凈的載玻片上，抹片，自然干燥后，甲醇固定，姬姆薩染色12 h，鏡下觀察豬附紅細(xì)胞體的感染情況。

1.2.1.2 PCR檢測(cè) 根據(jù)GenBank中登錄的豬附紅細(xì)胞體膜蛋白OxaA序列（CBZ40902.1），應(yīng)用Primer Premier 5.0和 Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)引物，上游引物 P1：5′－TCTTATGTCTTTGTTGTAAATCTG－3′；下游引物P2：5′－TTTTCAATCTATGTTCACCTCA－3′。擴(kuò)增片段大小386 bp。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min；94℃45 s，57℃45 s，72℃45 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min，4℃結(jié)束反應(yīng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g／L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。

1.2.2 血液學(xué)指標(biāo)的測(cè)定 使用全自動(dòng)動(dòng)物血液細(xì)胞分析儀，按常規(guī)方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3 血清生化指標(biāo)的測(cè)定 使用全自動(dòng)動(dòng)物血液細(xì)胞分析儀，按常規(guī)方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)方法 各試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用t檢驗(yàn)方法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 姬姆薩染色鏡檢

經(jīng)過姬姆薩染色鏡檢，可見紅細(xì)胞呈紫紅色，豬附紅細(xì)胞體成實(shí)體狀態(tài)，有折光性（圖1）。感染豬附紅細(xì)胞體的紅細(xì)胞表面附著1個(gè)～5個(gè)不等。

2.2 PCR檢測(cè)

以被檢豬全血基因組DNA為模板，應(yīng)用特異性P1和P2引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得386 bp的目的基因片段，與預(yù)期大小一致（圖2）。

圖1 豬附紅細(xì)胞體姬姆薩染色（1 000×）Fig.1 Giemsa staining of Eperythrozoon suis（1 000×）

2.3 仔豬血液學(xué)指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果

對(duì)仔豬進(jìn)行紅細(xì)胞數(shù)（RBC）、白細(xì)胞數(shù)（WBC）、紅細(xì)胞壓積（HCT）、平均紅細(xì)胞體積（MCV）、血 紅 蛋 白 （HGB）、平 均 紅 細(xì) 胞 體 積（MCV）、平均血紅蛋白含量（MCH）、平均血紅蛋白濃度（MCHC）、血小板數(shù)目（PLT）、血小板壓積（PCT）、紅細(xì)胞分布寬度變異系數(shù)（RDW）、血小板分布寬度（PDW）、平均血小板體積（MPV）等指標(biāo)的測(cè)定。結(jié)果自然感染豬附紅細(xì)胞體病的仔豬的WBC、PLT、PCT、RDW、MPV 升高，RBC、HGB、HCT、MCV、MCH、PDW等指標(biāo)降低，表現(xiàn)出患病仔豬有貧血傾向（表1）。

經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以上各項(xiàng)指標(biāo)顯性感染階段和陰性值相比差異極顯著（P＜0.01），隱性感染階段和顯性感染階段相比差異極顯著（P＜0.01），RBC、HGB、MCV、PLT、RDW 隱性感染階段和陰性值相比差異顯著（P＜0.05），其余指標(biāo)隱性感染階段和陰性值相比差異不顯著（P＞0.05）。

對(duì)仔豬進(jìn)行白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)，淋巴細(xì)胞（LYM）、中性粒細(xì)胞（GRAN）、單核細(xì)胞（MON）。結(jié)果，自然感染豬附紅細(xì)胞體病的仔豬的LYM（%）升高，GRAN（%）降低，MON（%）無明顯變化（表2）。

表1 仔豬血液學(xué)指標(biāo)變化情況Table1 Hematology index changes in piglets

表2 仔豬白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)Table2 White blood cell counts in piglets

經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，LYM、GRAN、MON顯性感染階段與陰性值相比差異顯著（P＜0.05），隱性感染階段和顯性感染階段相比差異顯著（P＜0.05），隱性感染階段和陰性值相比差異不顯著（P＞0.05）。

2.4 仔豬血清生化指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果

對(duì)仔豬進(jìn)行谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（GGT）、葡萄糖（GLU）、甘油三酯（TG）、肌酐（CRE）、總膽固醇（TC）、尿素氮（BUN）等指標(biāo)的測(cè)定。結(jié)果，自然感染豬附紅細(xì)胞體病的仔豬的ALT、AST、ALP、CRE顯著升高，BUN降低，其余指標(biāo)無明顯變化（表3）。

經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，顯性感染階段 ALT、AST、ALP、GGT、CRE、BUN與陰性值相比差異極顯著（P＜0.01），隱性感染階段 ALT、AST、ALP、GGT、CRE、BUN與陰性值相比差異顯著（P＜0.05），其余指標(biāo)與陰性值相比差異不顯著（P＞0.05）。

3 討論

豬附紅細(xì)胞體病可使不同年齡的豬發(fā)病，但對(duì)仔豬的危害較為嚴(yán)重［4－7］。因此，本試驗(yàn)以長(zhǎng)白仔豬為對(duì)象，在姬姆薩染色鏡檢和PCR技術(shù)鑒定病原體的前提下，對(duì)自然感染豬附紅細(xì)胞體長(zhǎng)白仔豬的血液學(xué)指標(biāo)和血清生化指標(biāo)進(jìn)行了檢測(cè)。通過對(duì)仔豬的血液生理生化指標(biāo)的測(cè)定，明確了豬附紅細(xì)胞體可引起紅細(xì)胞數(shù)、紅細(xì)胞壓積、血紅蛋白等降低，白細(xì)胞總數(shù)升高，谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶等酶活性升高，而對(duì)血糖、甘油三酯、總膽固醇等指標(biāo)無影響。

表3 仔豬血清生化指標(biāo)的變化情況Table3 Seral biochemical index changes in piglets

PCR檢測(cè)法具有極高的敏感性和特異性，可以用于檢測(cè)急性豬附紅細(xì)胞體病和臨床健康的帶菌豬［8］。由于PCR技術(shù)具有快速、靈敏、特異性高等優(yōu)點(diǎn)，它已成為診斷豬附紅細(xì)胞體病的一種有效手段。因此，本試驗(yàn)在姬姆薩染色鏡檢病原體的基礎(chǔ)上，又進(jìn)行了PCR鑒定，使試驗(yàn)更為嚴(yán)謹(jǐn)，結(jié)果更為準(zhǔn)確。

目前，關(guān)于豬附紅細(xì)胞體病的防治，尚未有效的藥物和疫苗，所采取的防控措施也只能在一定程度上實(shí)施，不能從根本上解決問題［9－10］。而且，隨著豬附紅細(xì)胞體病的廣泛流行，豬附紅細(xì)胞體的致病性和抗原性出現(xiàn)了明顯的變異情況，給該病的臨床診斷帶來了極大困難，也給該病的深入研究帶來了嚴(yán)峻考驗(yàn)［11］。因此，本試驗(yàn)對(duì)現(xiàn)階段當(dāng)?shù)刈匀桓腥镜呢i附紅細(xì)胞體病長(zhǎng)白仔豬進(jìn)行了血液學(xué)指標(biāo)和血清生化指標(biāo)的檢測(cè)，旨在為豬附紅細(xì)胞體病的臨床診斷提供理論依據(jù)。

［1］陳啟軍，尹繼剛，劉明遠(yuǎn).附紅細(xì)胞體及附紅細(xì)胞體?。跩］.中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2006，26（4）：460－464.

［2］李書光，唐延平.豬附紅細(xì)胞體病研究進(jìn)展［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2008，35（10）：108－110.

［3］馮會(huì)權(quán)，巴彩鳳，蘇玉虹.附紅細(xì)胞體病研究綜述［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35（17）：5180－5182.

［4］韓子強(qiáng)，趙曉輝，于愛蓮.附紅細(xì)胞體的形態(tài)學(xué)研究［J］.中國病原生物學(xué)雜志，2008，3（11）：812－814.

［5］王生奎，趙海忠，李進(jìn)軍，等.豬附紅細(xì)胞體病研究進(jìn)展［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2006，27（S1）：36－40.

［6］張瑞光.豬附紅細(xì)胞體?。跩］.福建畜牧獸醫(yī)，2002（6）：23.

［7］楊前鋒，靳玉芬，馬發(fā)順.河南省豬附紅細(xì)胞體病的流行及診治［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2002（7）：26－27.

［8］王 妍，張守發(fā)，劉思國，等.豬附紅細(xì)胞體PCR檢測(cè)方法的建立［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，38（10）：2153－2156.

［9］劉明明，賈立軍，薛書江，等.豬附紅細(xì)胞體50S核糖體基因PCR診斷方法的建立及應(yīng)用［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2011，32（12）：47－50.

［10］姚 琳，張守發(fā)，賈立軍，等.豬附紅細(xì)胞體有效消毒劑的體外初步篩選試驗(yàn)［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2011，32（9）：125－128.

［11］劉明明，賈立軍，薛書江，等.吉林省延邊地區(qū)豬附紅細(xì)胞體病分子流行病學(xué)調(diào)查［J］.中國動(dòng)物檢疫，2011，28（11）：50－52.