影響壞死梭桿菌分泌白細(xì)胞毒素因素的研究

馮二凱，陳立志＊，劉曉穎，汪孫杰，2，曹 閱，徐 晶，2

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所 特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物分子生物學(xué)省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ，吉林吉林132109；2.江蘇科技大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212018）

壞死桿菌病是由壞死梭桿菌（Fusobacterium necrophorum）引起的牛、羊、鹿等家養(yǎng)和野生動(dòng)物常見的一類傳染病的總稱，主要包括牛肝膿腫［1］、犢牛白喉［2］和羊腐蹄病等。壞死桿菌病臨床發(fā)病率高、危害嚴(yán)重，給世界反芻動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，并正在成為制約我國反芻動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的重要因素。

目前，壞死桿菌病的臨床治療以抗生素預(yù)防為主，并輔以臨床處置，然而該措施并未徹底控制該病發(fā)生，反而增加了人們對(duì)食品公共安全的擔(dān)憂。而據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)證實(shí)，疫苗免疫才是預(yù)防和控制壞死桿菌病的根本措施。因?yàn)閴乃浪髼U菌滅活苗在腐蹄病的早期治療過程中發(fā)揮了積極作用，但也暴露其毒副作用大、免疫效果差等缺陷。因而急需開發(fā)一種針對(duì)性強(qiáng)、免疫效果好且毒副作用小的亞單位疫苗，以減輕壞死桿菌病給養(yǎng)殖業(yè)造成的巨大經(jīng)濟(jì)損失。

壞死梭桿菌屬于條件性致病菌，能釋放包括內(nèi)毒素、血凝素、溶血素在內(nèi)多種毒力因子，造成其致病機(jī)理非常復(fù)雜。近年來，一種對(duì)反芻動(dòng)物白細(xì)胞，特別是對(duì)多形核白細(xì)胞（polymorph nuclear leukocytes，PMNs）有特異性細(xì)胞毒性作用的外毒素—白細(xì)胞毒素（leukotoxin，Lkt），因具有良好的免疫原性［3－4］而成為了研制治療壞死梭桿菌病高效疫苗的靶標(biāo)［5－7］，但目前有關(guān)壞死梭桿菌白細(xì)胞毒素報(bào)道存在嚴(yán)重問題，內(nèi)容涉及白細(xì)胞毒素的穩(wěn)定性、分子質(zhì)量、生物學(xué)特性等方面［8－10］，這給體外制備壞死梭桿菌天然白細(xì)胞毒素疫苗造成很大困難。本研究基于已分離的壞死梭桿菌國內(nèi)流行株，體外考察細(xì)菌培養(yǎng)條件對(duì)壞死梭桿菌分泌白細(xì)胞毒素能力的影響，為研制壞死梭桿菌天然白細(xì)胞毒素亞單位疫苗和研究白細(xì)胞毒素致病機(jī)理提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)菌菌株 壞死梭桿菌FN（2）株和FN（AB）株以及抗壞死梭桿菌白細(xì)胞毒素BSBSE重組蛋白的兔血清由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所省部共建特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物分子生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 試劑 Ex Taq DNA聚合酶和 DL2 000為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；酶標(biāo)二抗為北京博奧森公司產(chǎn)品；其他試劑為分析純。

1.2 方法

1.2.1 壞死梭桿菌生物型鑒定 取出－80℃貯藏的壞死梭桿菌凍干粉，1 mL滅菌生理鹽水溶解后接種10 mL新鮮配制厭氧、無菌腦心浸液肉湯培養(yǎng)基（prereduced anaerobically sterilized brain heart infusion media，PRAS－BHI），37℃厭氧復(fù)壯培養(yǎng)48 h。革蘭染色確認(rèn)無雜菌污染。

牛源F.necrophorum流行株的生物亞型鑒定參照專利［11］完成。提取壞死梭桿菌基因組DNA，結(jié)合引物P1、P2和P3完成牛源壞死梭桿菌流行株生物型鑒定。P1和P2分別位于F.necrophorum subsp.necrophorum 亞種（Fnn）和F.necrophorum subsp.funduliform亞種（Fnf）的白細(xì)胞毒素啟動(dòng)子區(qū)，P3為下游公共引物（表1）。

表1 壞死梭桿菌生物亞型鑒定的特異性引物Table1 The specific primers for subtype identification of F.necrophorum

反應(yīng)條件：95℃10 min；94℃1min，56℃50 s，72℃1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃10 min。反應(yīng)結(jié)束后，10 g／L瓊脂糖電泳檢測(cè)結(jié)果。

1.2.2 壞死梭桿菌上清液白細(xì)胞毒性檢測(cè) 取已復(fù)壯培養(yǎng)48 h的壞死梭桿菌菌液，按1∶50比例接種新配制PRAS－BHI培養(yǎng)基，37℃厭氧培養(yǎng)細(xì)菌至對(duì)數(shù)生長期（OD600 nm＝ 0.8 ～1.0）；4℃，8 000 r／min離心30 min，收集上清，0.2μm 濾器濾過除菌，分裝成小份，置－80℃保存，用于測(cè)定白細(xì)胞毒性。

無菌采集10 mL牛頸靜脈血，裂解紅細(xì)胞制備PMNs。RPMI－1640（100 mL／L 胎牛血清）調(diào)整細(xì)胞密度至6×106cells／mL，100μL／孔鋪96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照，PBS填充邊緣孔，置37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。

培養(yǎng)物上清液白細(xì)胞毒性測(cè)定參照Tan Z L等［12］報(bào)道的方法，并加以改良。其過程為：次日，取出過夜培養(yǎng)PMNs細(xì)胞，小心吸出殘留RPMI－1640，每孔加入2倍比稀釋的壞死梭桿菌培養(yǎng)物上清液（100μL），混勻后置37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1 h，吸出殘留培養(yǎng)物，PBS清洗2次，每孔加入RPMI－1640（100μL）和20μL MTS［3－（4，5－dimethylthiazol－2－yl）－5－（3－carboxymethoxyphenyl）－2－（4－sulfophenyl）－2H－tetrazolium，內(nèi)鹽］，避光繼續(xù)培養(yǎng)4 h以形成甲瓚，492 nm處測(cè)定各孔吸光度。

1.2.3 細(xì)菌生物型對(duì)壞死梭桿菌上清液細(xì)胞毒性的影響 在PRAS－BHI培養(yǎng)基上，分別厭氧培養(yǎng)FN（2）和FN（AB）至對(duì)數(shù)生長期（OD600 nm＝0.93），8 000 r／min離心制備細(xì)菌培養(yǎng)物上清液，并參照1.2.2檢測(cè)FN（2）和FN（AB）培養(yǎng)物上清液的白細(xì)胞毒性，以分析細(xì)菌生物型對(duì)細(xì)菌培養(yǎng)物上清液白細(xì)胞毒性的影響。

1.2.4 培養(yǎng)基對(duì)壞死梭桿菌上清液白細(xì)胞毒性的影響 為考察培養(yǎng)基對(duì)培養(yǎng)物上清液白細(xì)胞毒性的影響，F(xiàn)N（2）和FN（AB）被分別在PRAS－BHI和改良MEB培養(yǎng)基中厭氧培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，離心收集培養(yǎng)物上清液，檢測(cè)其各自培養(yǎng)物上清液白細(xì)胞毒性，篩選最適制備白細(xì)胞毒素的細(xì)菌培養(yǎng)基。

1.2.5 p H對(duì)壞死梭桿菌上清液白細(xì)胞毒性的影響分別配制p H 7.3和p H 8.0 兩個(gè)梯度 PRASBHI培養(yǎng)基，分別接種已篩選最適壞死梭桿菌，制備培養(yǎng)物上清液，參照1.2.2檢測(cè)其各自培養(yǎng)物上清液白細(xì)胞毒性，篩選最適制備白細(xì)胞毒素的細(xì)菌培養(yǎng)基p H（p H 8.0培養(yǎng)物上清液在測(cè)定活性前，用2N HCl將p H調(diào)至7.3）。

1.2.6 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)壞死梭桿菌上清液白細(xì)胞毒性的影響 取已復(fù)壯最適生物型F.necrophorum接種PRAS－BHI（100 mL），37℃厭氧培養(yǎng)；分別在6、12、24 h取5 mL細(xì)菌培養(yǎng)物用于測(cè)定白細(xì)胞毒素活性。白細(xì)胞毒素制備與活性測(cè)定參照1.2.2完成。

1.2.7 Western blot分析 基于已篩選的壞死梭桿菌白細(xì)胞毒素最適制備參數(shù)條件，制備壞死梭桿菌上清液3 500 mL，4℃超濾濃縮100倍（截留分子質(zhì)量100 ku），并將截留產(chǎn)物定義為壞死梭桿菌天然白細(xì)胞毒素，分裝成小份，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

壞死梭桿菌天然白細(xì)胞毒素經(jīng)SDS－PAGE電泳后，半干轉(zhuǎn)移至NC膜上，以抗白細(xì)胞毒素BSBSE重組蛋白兔血清為一抗，偶聯(lián)辣根過氧物酶的山羊抗兔IgG為二抗，進(jìn)行 Western blot分析，DAB顯色，記錄結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 壞死梭桿菌生物型鑒定

圖1顯示的是壞死梭桿菌生物型鑒定結(jié)果。從圖中可以看出FN（AB）擴(kuò)增出片段約為1 076 bp，屬于A型，也就是Fnn；FN（2）株擴(kuò)增片段大約為809 bp，屬于B型，即Fnf。

2.2 細(xì)菌生物型對(duì)壞死梭桿菌上清液白細(xì)胞毒性的影響

細(xì)菌生物型對(duì)壞死梭桿菌培養(yǎng)物上清液白細(xì)胞毒性的影響如圖2所示。在培養(yǎng)物上清液被稀釋1倍～4倍范圍內(nèi)，F(xiàn)N（AB）培養(yǎng)物上清液的白細(xì)胞毒性要顯著高于FN（2）培養(yǎng)物上清液的白細(xì)胞毒性（P＜0.05）。

圖2 細(xì)菌生物型對(duì)壞死梭桿菌上清液白細(xì)胞毒性的影響Fig.2 Effect of subtype on leukotoxicity of supernatant of F.necrophorum

2.3 培養(yǎng)基對(duì)壞死梭桿菌上清液白細(xì)胞毒性的影響

改良MEB培制備的細(xì)菌培養(yǎng)物上清液的細(xì)胞毒性低于PRAS－BHI制備的細(xì)菌培養(yǎng)物上清液的細(xì)胞毒性，二者差異顯著（p＜0.05），這種差異在FN（2）和FN（AB）上清液毒性檢測(cè)過程中都存在（圖3和圖4）。

2.4 p H對(duì)壞死梭桿菌上清液的影響

p H為7.3的培養(yǎng)基制備的壞死梭桿菌上清液對(duì)PMNs的細(xì)胞毒性作用要高于p H 8.0培養(yǎng)基制備的細(xì)菌培養(yǎng)物上清液對(duì)PMNs的細(xì)胞毒性，但二者之間的差異并不顯著（圖5）。

2.5 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)壞死梭桿菌上清液白細(xì)胞毒性的影響

壞死梭桿菌上清液的白細(xì)胞毒性自接種細(xì)菌開始呈逐漸增強(qiáng)趨勢(shì)（圖6），12 h左右時(shí)，上清液白細(xì)胞毒性達(dá)到最大值，然后開始下降，24 h時(shí)的培養(yǎng)物上清液白細(xì)胞毒性與6 h時(shí)的培養(yǎng)物上清液白細(xì)胞毒性相似。

圖3 培養(yǎng)基對(duì)FN（2）培養(yǎng)物上清液白細(xì)胞毒性的影響Fig.3 Effect of media on leukotoxicity of supernatant of F.necrophorum

圖4 培養(yǎng)基對(duì)FN（AB）培養(yǎng)物上清液白細(xì)胞毒性的影響Fig.4 Effect of media on leukotoxicity of supernatant of F.necrophorum strain AB

圖5 p H對(duì)細(xì)菌培養(yǎng)物上清液白細(xì)胞毒素的影響Fig.5 Effects of p H on leukotoxicity of supernatant of F.necrophorum

圖6 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)培養(yǎng)物上清液細(xì)胞毒性的影響Fig.6 Effects of culture time on leukotoxicity of supernatant of F.necrophorum

2.6 SDS－PAGE電泳與 Western blot分析結(jié)果

壞死梭桿菌天然白細(xì)胞毒素經(jīng)SDS－PAGE后（圖7），轉(zhuǎn)移至NC膜上進(jìn)行免疫活性分析，結(jié)果如圖8所示?；贐HI培養(yǎng)基制備的壞死梭桿菌天然白細(xì)胞毒素，有2條帶能被抗重組白細(xì)胞毒素BSBSE蛋白片段的兔血清所識(shí)別，其中131 ku蛋白質(zhì)與抗重組白細(xì)胞毒素BSBSE血清反應(yīng)強(qiáng)烈。

3 討論

白細(xì)胞毒素是壞死梭桿菌在增殖過程中分泌至細(xì)胞外的一種毒素，因其與壞死梭桿菌致病性密切相關(guān)［13］，而被認(rèn)為是壞死桿菌感染宿主發(fā)病的重要毒力因子［14－15］。研究表明壞死梭桿菌分泌白細(xì)胞毒素的能力受細(xì)菌生物型、細(xì)菌濃度和培養(yǎng)周期等多種因素的綜合影響［16］。如Sanlan C M 等［10］報(bào)道 A型壞死梭桿菌分泌白細(xì)胞毒素能力最強(qiáng)，AB型次之，B型最少。在本研究中，為考察細(xì)菌生物型對(duì)壞死梭桿菌培養(yǎng)物上清液白細(xì)胞毒性的影響，首先利用壞死梭桿菌生物型鑒定專利技術(shù)對(duì)本研究室早期分離保存的壞死梭桿菌臨床分離株的生物型進(jìn)行了鑒定，并根據(jù)鑒定結(jié)果比較了各自生物型細(xì)菌上清液的白細(xì)胞毒性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)FN（AB）對(duì)PMNs的細(xì)胞毒性顯著高于FN（2）（B型）（圖2），并且這種毒性差異不因培養(yǎng)基的改變而改變。因而在制備類壞死梭桿菌類白細(xì)胞毒素疫苗時(shí)，應(yīng)選擇生物型A細(xì)菌作為生產(chǎn)用種子菌。

除細(xì)菌生物型外，培養(yǎng)基類型對(duì)培養(yǎng)物上清液的白細(xì)胞毒性也有很大影響。有研究表明，比起營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基或硫乙醇酸鹽肉湯培養(yǎng)基，Eugon broth培養(yǎng)基或改良Eugon broth培養(yǎng)基更適合于制備白細(xì)胞毒素［17］。但本研究結(jié)果顯示，無論是在以FN（AB）為種子菌的試驗(yàn)中，還是在FN（2）的試驗(yàn)中，改良MEB培養(yǎng)基制備的培養(yǎng)物上清液的白細(xì)胞毒性要遠(yuǎn)低于PRAS－BHI培養(yǎng)基制備的細(xì)菌培養(yǎng)物上清液的白細(xì)胞毒性（圖3和圖4），而MEB培養(yǎng)基以Eugon broth為主要營養(yǎng)成分。這表明PRAS－BHI更適合于制備壞死梭桿菌天然白細(xì)胞毒素疫苗；推測(cè)培養(yǎng)基影響細(xì)菌培養(yǎng)物上清液白細(xì)胞毒性的原因可能與培養(yǎng)基支持細(xì)菌生長能力差異有關(guān)。

影響培養(yǎng)物上清液白細(xì)胞毒性的因素還包括培養(yǎng)基p H和細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間。從本試驗(yàn)獲得的結(jié)果看，培養(yǎng)基p H對(duì)細(xì)菌培養(yǎng)物上清液白細(xì)胞毒性影響并不顯著（圖5），但考慮到白細(xì)胞毒素的不穩(wěn)定性，高p H可能會(huì)導(dǎo)致白細(xì)胞毒素發(fā)生降解，因此制備白細(xì)胞毒素的細(xì)菌培養(yǎng)基p H范圍建議選擇7.3；培養(yǎng)時(shí)間對(duì)壞死梭桿菌培養(yǎng)物上清液白細(xì)胞毒性的影響表現(xiàn)出明顯地生長周期依賴性（圖6）。細(xì)菌培養(yǎng)物上清液白細(xì)胞毒性最大值出現(xiàn)在對(duì)數(shù)生長期后期（10 h～12 h），然后開始下降，至24 h時(shí)，細(xì)菌培養(yǎng)物上清液的白細(xì)胞毒性與6 h時(shí)的細(xì)菌培養(yǎng)物上清液的白細(xì)胞毒性相似。推測(cè)引起細(xì)菌培養(yǎng)物上清液白細(xì)胞毒性下降的原因可能是進(jìn)入衰老期的細(xì)菌發(fā)生裂解，釋放出大量的蛋白質(zhì)水解酶，導(dǎo)致白細(xì)胞毒素被降解［16］。

壞死梭桿菌天然白細(xì)胞毒素是一種低穩(wěn)定性細(xì)胞外蛋白質(zhì)，這在本研究中也得到了驗(yàn)證。Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)有2條蛋白條帶能被抗白細(xì)胞毒素重組蛋白BSBSE的兔血清所識(shí)別（圖7），說明白細(xì)胞毒素發(fā)生了降解，但不影響其反應(yīng)原性，這與Tan等報(bào)道的結(jié)果一致［9］，綜上所述，預(yù)還原、厭氧無菌心腦浸液肉湯培養(yǎng)基（p H 7.3），培養(yǎng)細(xì)菌10 h～12 h左右（對(duì)數(shù)生長期），此工藝條件下獲取的細(xì)菌培養(yǎng)物上清液的白細(xì)胞毒性最大；同時(shí)超濾獲得的粗提白細(xì)胞毒素經(jīng)Western bolt證實(shí)也具有免疫反應(yīng)性，這表明獲得的生產(chǎn)工藝可以作為制備壞死梭桿菌天然白細(xì)胞毒素疫苗的生產(chǎn)工藝條件，這些數(shù)據(jù)也將為研制壞死梭桿菌白細(xì)胞毒素亞單位疫苗提供一些基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

致謝：作者對(duì)北華大學(xué)生命科學(xué)研究中心主任孫新教授給予本試驗(yàn)的幫助表示衷心地感謝！

［1］Nagaraja T G，Chengappa M M.Liver abscesses in feedlot cattle：a review ［J］.J Anim Sci，1998，76：287－298.

［2］Nagaraja T G，Narayanan S K，Stewart G C，et al.F.necrophoruminfections in animals：pathogenesis and pathogenic mechanisms［J］.Anaerobe，2005，11：239－246.

［3］Clark B L，Emery D L，Steward D J，et al.Studies of immunization of cattle against interdigital necrobacillosis ［J］.Aust Vet J，1986，63：107－110

［4］Tan Z L，Lechtenberg K F，Nagaraja T G，et al.Serum neutralizing antibodies against F.necrophorumLeukotoxin in cattle with experimentally induced or naturally developed hepatic ab－scess［J］.J Anim Sci，1994，72（2）：502－508.

［5］Nagaraja T G，Chengappa M M.F.necrophorumLeukotoxin vaccine［P］：US，005455034A，1995－10－3.

［6］Saginala S，Nagaraja T G，Tan Z L，et al.The serum neutralizing antibody response in cattle to F.necrophorumLeukotoxoid and possible protection against experimentally induced hepatic abscesses［J］.Am J Vet Res，1996，57（4）：483－488.

［7］Saginala S，Nagaraja，T G，Lechtenberg，K F，et al.Effect of F.necrophorumLeukotoxoid vaccine on susceptibility to experimentally induced liver abscesses in cattle ［J］.J Anim Sci，1997，75（4）：1160－1166.

［8］Garacia M M，Alexander D C，Mckay K A.Biological characterization of F.necrophorum cell fractions in preparation for toxin and immunization studies［J］.Infect Immun，1975，11：609－611.

［9］Tan Z L，Nagaraja T G，Chengappa M M，et al.Biological and biochemical characterization of F.necrophorumLeukotoxin［J］.Am J Vet Res，1994，55：515－521.

［10］Scanlan C M，Berg J N，Campbell F F.Biochemical characterization of the leukotoxin of three bovine strains of F.necrophorum ［J］.Am J Vet Res，1986，47：1422－1425.

［11］陳立志，姚志利，王克堅(jiān)，等.一種壞死梭桿菌的基因檢測(cè)分型方法及試劑盒［P］.中國：201010289795.4.2011－01－26.

［12］Tan Z L，Nagaraja T G，Chengappa M M.Factors affecting leukotoxin activity of F.necrophorum ［J］.Vet Microbiol，1992，33：15－28.

［13］Coyle－Dennis J E，Lauerman L H.Correlations between leukocidin production and virblence of two isolates of F.necrophorum ［J］.Am J Ver Res，1979，40：274－276.

［14］Narajanan S K，Chengappa M M.Immunogenicity and protective effects of truncated recombinant leukotoxin proteins of F.necrophorumin mice［J］.Vet Microbiol，2003，93（4）：335－347

［15］Sun，D B，Wu R，Li G L，et al.Identification of three immunodominant regions on leukotoxin protein of F.necrophorum［J］.Vet Res Commun，2009，33（7）：749－755.

［16］Tan Z L，Nagaraja T G，Chengappa M M.Factors affecting leukotoxin activity of F.necrophorum ［J］.Vet Microbiol，1992，32（1）：15－28.

［17］Emery D L，Duffy J H，Clark B L.Biochemical and functional properties of a leukocidin produced by several strains of F.necrophorum ［J］.Aust Vet J，1984，61：382－387