放射性碘-131標(biāo)記酪氨酸*

李澤軍 褚泰偉

(北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院 北京 100871)

目前, 放射性標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于化學(xué)、生物學(xué)和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域，例如化學(xué)反應(yīng)機(jī)理的研究、放射性免疫分析以及疾病的早期診斷和治療等。因此，在本科生綜合化學(xué)實(shí)驗(yàn)中開(kāi)展與放射化學(xué)相關(guān)的實(shí)驗(yàn)，讓學(xué)生掌握該學(xué)科的基本知識(shí)和操作常識(shí)，是有意義的。

放射性碘-131具有半衰期短(8.02天)，價(jià)格便宜，易于購(gòu)買(mǎi)等優(yōu)點(diǎn)。放射性碘標(biāo)記化合物在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)中應(yīng)用很廣泛，是常用的示蹤手段之一。常用的標(biāo)記方法為利用氧化劑，如氯氨-T(Chloramine-T)、Iodogen、溴代琥珀酰亞胺(NBS)等將放射性碘負(fù)離子氧化為具有親電活性的放射性碘，這些放射性碘進(jìn)而和化合物中的苯環(huán)發(fā)生親電取代反應(yīng)以完成標(biāo)記[1-5]。酪氨酸分子中有被羥基取代的苯環(huán)，易于發(fā)生親電取代反應(yīng)，易于被碘標(biāo)記。如欲對(duì)蛋白質(zhì)或其他化合物進(jìn)行碘標(biāo)記，需先將酪氨酸及其衍生物與蛋白質(zhì)或其他化合物偶聯(lián)，然后再完成放射性碘的標(biāo)記[6]。本實(shí)驗(yàn)利用氯氨-T、Iodogen為氧化劑，氧化碘-131負(fù)離子(131I-)標(biāo)記酪氨酸分子。研究了不同的標(biāo)記條件，如：溶液pH、底物濃度、氧化劑用量、載體加入量對(duì)標(biāo)記率的影響，從而尋找最佳標(biāo)記條件。通過(guò)該實(shí)驗(yàn)，學(xué)生可以初步掌握放射性碘標(biāo)記化合物的常用方法，同時(shí)訓(xùn)練放射化學(xué)操作的基本技能。

1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/h2>

(1) 了解放射性碘標(biāo)記化合物的原理；

(2) 了解放射性碘標(biāo)記化合物的兩種常用實(shí)驗(yàn)技術(shù)與方法；

(3) 了解不同標(biāo)記條件對(duì)標(biāo)記率的影響。

2 實(shí)驗(yàn)原理

氯氨-T和Iodogen是碘標(biāo)記化合物常用的氧化劑，其分子結(jié)構(gòu)如圖1所示。氯氨-T是水溶性的，在水溶液中生成HOCl，將放射性I-氧化為放射性的I2，放射性的I2進(jìn)而和化合物的苯環(huán)發(fā)生親電取代反應(yīng)，制得碘標(biāo)記化合物[3]。Iodogen標(biāo)記化合物的原理和氯氨-T一致，但I(xiàn)odogen不溶于水，標(biāo)記化合物時(shí)可以減少與水溶性有機(jī)分子的接觸從而減少其氧化損傷，所以氧化條件較為溫和[7-8]。氯氨-T氧化標(biāo)記法和Iodogen氧化標(biāo)記法是碘標(biāo)記化合物常用的兩種方法。

酪氨酸由于分子內(nèi)部有被羥基活化了的苯環(huán)，碘的親電取代反應(yīng)很容易在羥基的鄰位發(fā)生。因此，很容易被碘標(biāo)記成功。其反應(yīng)式如圖2所示。

圖1 兩種常用氧化劑的分子結(jié)構(gòu)

圖2 放射性碘-131標(biāo)記酪氨酸分子

本實(shí)驗(yàn)采取紙上色譜法來(lái)確定標(biāo)記率。由于碘標(biāo)記的酪氨酸分子和未被標(biāo)記上的131I-性質(zhì)不同，它們?cè)诠潭ㄏ嗪土鲃?dòng)相(展開(kāi)劑)之間的分配比不同。因此，在流動(dòng)相展開(kāi)過(guò)程中，被標(biāo)記的酪氨酸分子和未被標(biāo)記上的131I-隨溶劑的移動(dòng)速度不同而被分離開(kāi)，放射性被分布于紙帶的不同區(qū)域。標(biāo)記率即為標(biāo)記化合物區(qū)域的放射性活度占整條紙帶的放射性活度的百分比。

3 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器

無(wú)載體Na131I溶液(原子高科股份有限公司)，酪氨酸(上?？到萆锟萍及l(fā)展有限公司)，氯氨-T(ACROS ORGANICS)，Iodogen(Sigma)，甲醇(分析純)，正丁醇(分析純)，冰醋酸(分析純)，Na2S2O5(分析純)，去離子水，85%磷酸(分析純)，KOH(分析純)，氯仿(分析純)，色譜用濾紙(寬1.5cm，長(zhǎng)25.0cm)，玻璃展開(kāi)缸，F(xiàn)T-603井型γ閃爍探頭和FH463A-自動(dòng)定標(biāo)器(中核(北京)核儀器廠)。

4 實(shí)驗(yàn)步驟

4.1 溶液配制和原料準(zhǔn)備

(1) 0.1mol/L KOH水溶液用85%的磷酸溶液調(diào)pH=3、5、7、9、11。

(2) 將酪氨酸分別溶于pH 3～11的KOH-H3PO4溶液中，質(zhì)量濃度為0.2mg/mL。

(3) 將酪氨酸溶于pH 7的KOH-H3PO4溶液中，質(zhì)量濃度分別為0.05、0.1、0.15、0.2、0.3mg/mL。

(4) 配制氯氨-T水溶液，質(zhì)量濃度分別為0、1、2、3、4mg/mL。

(5) 配制Iodogen的氯仿溶液，質(zhì)量濃度分別為0、0.02、0.04、0.06、0.08mg/mL。分別取0.5mL上述溶液于離心管中，在通風(fēng)櫥中揮發(fā)干氯仿，Iodogen被涂于離心管內(nèi)壁，制得不同Iodogen含量的離心管若干。

(6) 配制Na2S2O5水溶液，質(zhì)量濃度為30mg/mL。

(7) 在距離濾紙條一端2cm處標(biāo)記好點(diǎn)樣位置，每隔1cm畫(huà)一個(gè)標(biāo)記，共畫(huà)10cm。

(8) 配制85%甲醇展開(kāi)體系，取適量展開(kāi)劑于玻璃展開(kāi)缸中。

4.2 色譜展開(kāi)條件的選擇

4.3 溶液pH對(duì)標(biāo)記率的影響

以氯氨-T為氧化劑：分別取pH 3～11的酪氨酸溶液(0.2mg/mL)0.5mL于離心管中，加入10 μL氯氨-T溶液(2mg/mL)，1.85MBq Na131I溶液，反應(yīng)10分鐘后加入50μL Na2S2O5溶液(30mg/mL)終止反應(yīng)。

以Iodogen為氧化劑：取0.04 mg/mL Iodogen的氯仿溶液揮干溶劑后的離心管5支，分別加入pH 3～11的酪氨酸溶液(0.2mg/mL)0.5mL，加入1.85MBq Na131I溶液，反應(yīng)10分鐘后加入50μL Na2S2O5溶液(30mg/mL)終止反應(yīng)。

用做好標(biāo)記的濾紙條，對(duì)以上反應(yīng)液點(diǎn)樣分析。在正丁醇-冰醋酸-水的展開(kāi)體系中展開(kāi)10cm，記下溶劑前沿。風(fēng)干后剪成1cm寬的紙片裝入一次性塑料試管中，用FT-603井型γ閃爍探頭測(cè)量其放射性，計(jì)算標(biāo)記率。

4.4 底物質(zhì)量濃度對(duì)標(biāo)記率的影響

分別以氯氨-T和Iodogen為氧化劑，取質(zhì)量濃度為0.05、0.1、0.15、0.2、0.3mg/mL的酪氨酸溶液0.5mL(pH 7)，其他標(biāo)記條件同4.3節(jié)，反應(yīng)結(jié)束后分析產(chǎn)物，方法同4.3節(jié)。

4.5 氧化劑用量對(duì)標(biāo)記率的影響

以氯氨-T為氧化劑：取酪氨酸溶液(0.2mg/mL，pH 7)0.5mL，分別加入10μL 0、1、2、3、4mg/mL的氯氨-T溶液，1.85MBq Na131I溶液，反應(yīng)10分鐘后加入50 μL Na2S2O5溶液(30mg/mL)終止反應(yīng)。

以Iodogen為氧化劑：取酪氨酸溶液(0.2mg/mL，pH 7)0.5mL，分別加入由0.5mL 0、0.02、0.04、0.06、0.08mg/mL Iodogen的氯仿溶液揮干溶劑后的離心管，加入1.85MBq Na131I溶液，反應(yīng)10分鐘后加入50μL Na2S2O5(30 mg/mL)溶液終止反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后分析產(chǎn)物，方法同4.3節(jié)。

4.6 載體加入量對(duì)標(biāo)記率的影響

分別以氯氨-T和Iodogen為氧化劑，將0、50、100、500、1000μg載體KI與1.85MBq Na131I溶液混合后加入酪氨酸溶液(0.2mg/mL，pH 7)，其他標(biāo)記條件同4.3節(jié)。反應(yīng)結(jié)束后分析產(chǎn)物，方法同4.3節(jié)。

5 結(jié)果與討論

5.1 溶液pH對(duì)標(biāo)記率的影響

研究了不同溶液pH對(duì)標(biāo)記率的影響，結(jié)果如表1所示。分別以氯氨-T和Iodogen為氧化劑時(shí)，最大標(biāo)記率均在pH 7(氯氨-T：80%，Iodogen：83%)。表明中性溶液為最佳的標(biāo)記條件，酸性溶液和堿性溶液對(duì)碘標(biāo)記不利。這可能是由于酪氨酸分子中的酚羥基和氨基結(jié)構(gòu)隨溶液pH變化影響碘標(biāo)記所致。

表1 不同pH條件下的標(biāo)記率

5.2 底物質(zhì)量濃度對(duì)標(biāo)記率的影響

研究了不同底物質(zhì)量濃度對(duì)標(biāo)記率的影響，結(jié)果表明分別以氯氨-T和Iodogen為氧化劑時(shí)，不同的底物質(zhì)量濃度(0.05～0.3mg/mL)均可達(dá)到80%的標(biāo)記率，這表明在0.05～0.3mg/mL范圍內(nèi)，底物質(zhì)量濃度對(duì)標(biāo)記率影響不大。

5.3 氧化劑用量對(duì)標(biāo)記率的影響

研究了不同氧化劑用量對(duì)標(biāo)記率的影響，結(jié)果表明分別以氯氨-T和Iodogen為氧化劑時(shí)(圖3)，用量為0.02mg即可達(dá)到最大標(biāo)記率(氯氨-T：80%，Iodogen：83%)；進(jìn)一步增加氧化劑用量對(duì)標(biāo)記率影響不大。因此，在標(biāo)記化合物時(shí)，可將氧化劑用量控制在最低，這樣有利于保護(hù)被標(biāo)記的分子。

5.4 載體加入量對(duì)標(biāo)記率的影響

研究了不同載體加入量對(duì)標(biāo)記率的影響，結(jié)果表明分別以氯氨-T和Iodogen為氧化劑時(shí)，加入50μg載體KI即可使標(biāo)記率明顯下降(氯氨-T：50%，Iodogen：35%)；載體加入量超過(guò)100μg，標(biāo)記率降低至15%以下(圖4)。這可能是由于載體I-與131I-之間的競(jìng)爭(zhēng)所致。

圖3 氧化劑用量對(duì)標(biāo)記率的影響

圖4 KI加入量對(duì)標(biāo)記率的影響

6 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)探索了放射性碘-131標(biāo)記酪氨酸分子不同的標(biāo)記條件，結(jié)果表明：中性溶液有利于碘標(biāo)記；增加氧化劑用量可以提高標(biāo)記率，但應(yīng)盡量將氧化劑用量控制在最低；少量的載體加入量即明顯降低標(biāo)記率。因此，溶液pH、氧化劑用量和載體加入量對(duì)標(biāo)記率影響最大。

7 實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

因本實(shí)驗(yàn)涉及放射性實(shí)驗(yàn)操作，應(yīng)注意以下事項(xiàng)：(1) 所有放射性操作應(yīng)該戴乳膠手套進(jìn)行，禁止戴手套觸摸實(shí)驗(yàn)藥品、公用儀器、門(mén)窗把手等。(2) 所有放射性操作應(yīng)該在鋪有吸水紙的搪瓷盤(pán)中進(jìn)行，以防止污染。一旦發(fā)現(xiàn)污染應(yīng)立即向老師匯報(bào)。(3)穿實(shí)驗(yàn)室統(tǒng)一配備的實(shí)驗(yàn)服，禁止將實(shí)驗(yàn)服帶出實(shí)驗(yàn)室。(4) 實(shí)驗(yàn)廢物和廢液要統(tǒng)一回收處理，禁止亂扔亂倒。(5) 學(xué)生離開(kāi)實(shí)驗(yàn)室前要洗手，并檢測(cè)手和衣物是否被污染，確定無(wú)污染方可離開(kāi)實(shí)驗(yàn)室。

本實(shí)驗(yàn)可作為大三或大四本科生的綜合化學(xué)實(shí)驗(yàn)。如學(xué)時(shí)安排有限，可省略某些步驟。如：色譜展開(kāi)條件的選擇和底物濃度對(duì)標(biāo)記率的影響；或者改為只利用一種氧化劑在不同標(biāo)記條件下進(jìn)行標(biāo)記。學(xué)生通過(guò)本實(shí)驗(yàn)?zāi)艹醪秸莆辗派湫缘幕静僮?，增?qiáng)對(duì)放射性及輻射防護(hù)基本知識(shí)的了解，這樣有利于學(xué)生克服對(duì)放射性的恐懼心理，激發(fā)他們對(duì)放射化學(xué)的興趣。

[1] Hunter W M,Greenwood F C.Nature,1962,194(4827):495

[2] Greenwood F C,Hunter W M,Glover J S.BiochemJ,1963,89(1):114

[3] Seevers R H,Counsell R E.ChemRev,1982,82(6):575

[4] Bakir M A,Eccles S A,Babich J W,etal.JNuclMed,1992,33(12):2154

[5] Li Z J,Chu T W,Liu X Q,etal.NuclMedBiol,2005,32(3):225

[6] Farah K,Farouk N.JLabelCompdRadiopharm,1998,41(4):255

[7] Petzold G,Coenen H H.JLabelCompdRadiopharm,1981,18(9):1319

[8] Salisburry J G,Graham J M.BiochemJ,1981,194(1):351