四君子湯對脾虛大鼠空腸黏膜損傷的修復(fù)作用及機(jī)制

劉發(fā)強(qiáng)，何玉英，李杰峰，張挪威，昝軍蘭，劉鳳華，許劍琴

（1．中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院中獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室，北京 海淀100193；2北京農(nóng)學(xué)院動物科技系，北京 昌平102206）

中（獸）醫(yī)脾虛證多表現(xiàn)消化系統(tǒng)功能障礙，證見完谷不化，食后作瀉，大便稀溏，消瘦等。近年來研究表明，脾虛證患者和大鼠模型的胃腸道組織會出現(xiàn)病理變化，如胃黏膜變薄，小腸絨毛損傷、萎縮，細(xì)胞器非正常變化等［1］。當(dāng)腸黏膜損傷時(shí)，機(jī)體啟動一系列反應(yīng)保證黏膜結(jié)構(gòu)的完整性，其中一個(gè)重要的反應(yīng)是腸組織再生，這是由腸干細(xì)胞參與的非常復(fù)雜的過程。細(xì)胞增殖標(biāo)記物－增殖細(xì)胞核抗原（Proliferating Cell Nuclear Antigen，簡稱 PCNA）是DNA聚合酶的重要輔助因子，常作為評價(jià)細(xì)胞增殖狀態(tài)的重要指標(biāo)［2］。腸道隱窩干細(xì)胞的分裂狀態(tài)作為評價(jià)指標(biāo)。PCNA生長因子可以調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的增殖、移行和分化，在維持腸黏膜穩(wěn)態(tài)及其結(jié)構(gòu)完整性方面發(fā)揮著重要作用［3］。有研究表明，胰島素 樣 生 長 因 子－1（insulin－like growth factor－1，IGF－1）可以加速腸黏膜損傷后的修復(fù)過程［4］。

四君子顆粒由黨參、白術(shù)、茯苓和甘草四味中藥組成，是治療脾虛證的經(jīng)典方劑。目前已有研究表明，四君子湯對大鼠和小鼠小腸免疫功能、胃腸運(yùn)動等生理活動有重要調(diào)節(jié)作用［5－6］，但在脾虛動物腸黏膜損傷修復(fù)過程中作用研究甚少?？漳c是食物消化、吸收的主要部位，為此，本試驗(yàn)檢測空腸中PCNA和IGF－1的表達(dá)，探討經(jīng)典方劑四君子湯對脾虛大鼠空腸修復(fù)過程的影響，為中獸醫(yī)脾虛證之實(shí)質(zhì)、四君子湯的藥理作用機(jī)制和臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 藥物及主要試劑、設(shè)備 成年SD雄性大鼠24只，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。利血平注射液（1mg／mL），購自廣東邦民制藥有限公司。四君子顆粒（黨參、白術(shù)、茯苓和炙甘草），購自湖北武當(dāng)生物制藥有限公司。石蠟（Sigma公司，美國）；蘇木精、伊紅（Sigma公司，美國）；乙醇、二甲苯（北京化工廠）；兔抗大鼠PCNA多抗（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；兔抗大鼠IGF－1單抗（Santa Cruz，美國）；兔抗體免疫組化試劑盒（南京凱基生物技術(shù)發(fā)展有限公司）；BH2型生物顯微鏡（Olympus，日本）。

1．2 動物分組、處理和樣本采集 試驗(yàn)大鼠24只適應(yīng)性飼養(yǎng)3d后，隨機(jī)分為對照組、脾虛組、四君子顆粒治療組和治療對照組，每組6只。試驗(yàn)第1～7天，脾虛組、四君子顆粒治療組和治療對照組大鼠以0．5mL／kg體重［7］劑量腹腔注射利血平，對照組以相同劑量和方法注射生理鹽水。試驗(yàn)第8天，處死脾虛組和對照組所有大鼠，每只大鼠取空腸中段5cm，置于4%中性甲醛溶液固定，用于制作石蠟切片。四君子顆粒治療組于試驗(yàn)第8天開始每天灌服濃度為0．5g／mL的四君子顆粒，8mL／kg·d（劑量根據(jù)人和大鼠體重?fù)Q算，系數(shù)為0．018［l8］；四君子顆粒用蒸餾水溶解），治療對照組灌服相同劑量生理鹽水，連續(xù)5d，于試驗(yàn)第13天處死兩組大鼠，采樣及樣本處理和保存方法同脾虛組。

1．3 空腸組織H．E．染色 石蠟切片經(jīng)二甲苯常規(guī)脫蠟，二甲苯∶無水酒精（1∶1）、無水酒精95%～50%下行梯度酒精中各5min，蘇木精染色約10 min，蒸餾水沖洗、0．5%鹽酸分色后，自來水沖洗藍(lán)化30min，經(jīng)蒸餾水沖洗、酒精脫水上行至95%后，放入0．5%伊紅酒精染液染色30s，再依次入95%酒精、無水酒精、二甲苯，最后用中性樹膠封片。

光鏡下觀察比較各組大鼠腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化，采用Image－Pro Plus 5．1 圖像分析系統(tǒng)，測量空腸絨毛長度、隱窩深度，每個(gè)腸道組織切片選取5視野進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，取其平均值。

1．4 PCNA和IGF－1免疫組織化學(xué)法染色 常規(guī)方法制作石蠟切片，切片厚度4μm。（1）常規(guī)脫蠟水合。二甲苯5min洗2次，二甲苯∶無水乙醇（1∶1）5min洗1次，無水乙醇5min洗2次，95%、90%、80%、70%、50%的乙醇各5min洗1次，ddH2O 5min洗1次，PBS 5min洗3次。（2）抗原修復(fù)。用檸檬酸鈉緩沖液（pH值6．0）于微波爐中煮沸（高火5min，中低火3min 3次）。修復(fù)后，組織切片自然涼至室溫。（3）封閉內(nèi)源性過氧化物酶3%H2O2室溫孵育20min。PBS中5min洗3次。（4）1%山羊血清37℃封閉20min。（5）一抗孵育。組織切片于200倍稀釋的抗體溶液中4℃孵育過夜。PBS中5min洗3次。（6）在抗兔生物素化二抗中，37℃孵育30min。PBS洗3次，每次5min。（7）在鏈親和素標(biāo)記 HRP溶液中，37℃孵育30 min。PBS洗3次，每次5min。（8）DAB顯色2～5 min，顯微鏡下掌控。ddH2O洗3次，每次5min。（9）蘇木精復(fù)染10min，1%鹽酸酒精分化，脫水、透明后，中性樹膠封片。

每組中隨機(jī)選取3只大鼠的切片，每個(gè)切片高倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，觀察染色情況。PCNA染色結(jié)果以空腸每個(gè)隱窩PCNA陽性細(xì)胞數(shù)表示；IGF－1染色結(jié)果以平均每個(gè)視野的IGF－1陽性細(xì)胞數(shù)表示。

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS Statistics 17．0統(tǒng)計(jì)軟件，顯著性分析采用t檢驗(yàn)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果

2．1 臨床觀察 脾虛組、四君子顆粒治療組和治療對照組大鼠在試驗(yàn)第3天出現(xiàn)精神倦怠、蜷縮，飲食、飲水量下降；試驗(yàn)第5天出現(xiàn)體重降低、肛門污穢、大便稀溏、被毛凌亂等癥狀。停止注射利血平至第13天取樣前，四君子顆粒治療組大鼠的精神狀態(tài)、體重、飲食、飲水恢復(fù)程度明顯好于治療對照組。

2．2 大鼠空腸形態(tài)學(xué)觀察 H．E．染色后觀察，脾虛組大鼠空腸絨毛頂端表皮脫落，絨毛、隱窩萎縮。四君子顆粒治療組的絨毛高度、隱窩深度顯著高于治療對照組（P＜0．05）；兩組空腸絨毛頂端損傷現(xiàn)象基本消失。見圖1、2。

2．3 PCNA的免疫組化檢測 中插彩版圖3和表1結(jié)果顯示，PCNA在4組大鼠空腸中都有表達(dá)。每個(gè)隱窩PCNA陽性細(xì)胞數(shù)脾虛組極顯著少于對照組（P＜0．01）；四君子顆粒治療組顯著多于治療對照組（P＜0．05）。

2．4 IGF－1的免疫組化檢測 表1結(jié)果顯示，大鼠空腸中IGF－1陽性細(xì)胞數(shù)脾虛組極顯著少于對照組（P＜0．01）；四君子顆粒治療組極顯著多于治療對照組（P＜0．01）。

圖1 空腸絨毛長度變化 圖2 空腸隱窩深度變化

表1 空腸PCNA和IGF－1免疫組化染色結(jié)果

3 討論

脾虛證動物模型建立有多種方法，譬如苦寒瀉下法、耗氣破氣法、利血平注射法，其中利血平注射法是比較常用和成熟的方法之一［9］。注射利血平后，大鼠出現(xiàn)行為障礙以及副交感神經(jīng)抑制所致體溫降低等癥狀［10］；本試驗(yàn)中，可見大鼠精神委靡，飲食、飲水、體重下降，大便稀溏，被毛凌亂，蜷縮等癥狀，與Zhao Ning等［10］人建立的大鼠脾虛模型癥狀表現(xiàn)基本一致。

胃腸道結(jié)構(gòu)損傷是脾虛動物表現(xiàn)消化道癥狀的重要原因。王清等［11］人用大黃煎液灌胃的方法建立脾虛大鼠模型后，觀察模型大鼠小腸的病理學(xué)變化，腸絨毛萎縮甚至消失，黏膜上皮壞死，小腸腺破壞嚴(yán)重；黏膜層可見較多的嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及嗜中性粒細(xì)胞。本試驗(yàn)以利血平建立的脾虛大鼠模型可見空腸絨毛尖端表皮細(xì)胞脫落，絨毛、隱窩萎縮等現(xiàn)象。

韓凌等［12］研究了四君子湯總多糖對大鼠小腸上皮株IEC－6細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果表明，四君子湯總多糖無論對正常生長細(xì)胞或?qū)ιL受到抑制的細(xì)胞都具有促進(jìn)增殖的作用。增殖細(xì)胞核抗原（PCNA），是真核細(xì)胞DNA聚合酶δ的推動因子，協(xié)調(diào)DNA復(fù)制過程。它的出現(xiàn)與細(xì)胞周期中DNA合成期（S期）密切相關(guān)［13］。PCNA可作為細(xì)胞增殖標(biāo)志，反映細(xì)胞分裂增殖的狀態(tài)。在PCNA免疫組織化學(xué)法染色試驗(yàn)中，可以著色的腸道隱窩細(xì)胞有隱窩干細(xì)胞、增殖放大細(xì)胞［14］。本試驗(yàn)中，脾虛組大鼠空腸隱窩中PCNA陽性細(xì)胞數(shù)顯著減少，說明脾虛大鼠隱窩干細(xì)胞、增殖放大細(xì)胞的分裂速度明顯降低，導(dǎo)致了脾虛組空腸絨毛和隱窩的萎縮。四君子顆粒治療組空腸隱窩中PCNA陽性細(xì)胞數(shù)顯著高于治療對照組，可見四君子顆粒能夠促進(jìn)隱窩干細(xì)胞、增殖放大細(xì)胞分裂增殖。由此表明，脾虛狀態(tài)下大鼠空腸隱窩中具有分裂增殖能力的細(xì)胞處于抑制狀態(tài)，四君子顆粒能夠有效地逆轉(zhuǎn)這種狀態(tài)。

生長因子在腸黏膜修復(fù)過程中扮演重要角色，可以通過促進(jìn)腸上皮細(xì)胞的移行、增殖和分化，參與胃腸道上皮的重建過程。IGF－1是眾多生長因子中的一員，在體外試驗(yàn)中IGF－1可以2～2．5倍地促進(jìn)腸上皮細(xì)胞的移行，對腸上皮細(xì)胞增殖有明顯促進(jìn)作用［14］。本試驗(yàn)中脾虛組IGF－1表達(dá)顯著降低，四君子顆粒能夠明顯促進(jìn)大鼠空腸中IGF－1的表達(dá)，提示脾虛狀態(tài)下腸黏膜的萎縮與IGF－1等生長因子的低表達(dá)有關(guān)，四君子顆粒能夠提高腸道組織修復(fù)相關(guān)因子IGF－1的表達(dá)，有助于腸道損傷后的修復(fù)重建過程。

綜上所述，脾虛證所見消化系統(tǒng)功能障礙與小腸黏膜損傷及其再生修復(fù)功能異常密切相關(guān)，四君子（顆粒）湯能夠提高脾虛大鼠空腸隱窩干細(xì)胞的增殖能力和腸黏膜修復(fù)重建相關(guān)因子IGF－1表達(dá)，有助于脾虛動物腸黏膜再生修復(fù)，改善和恢復(fù)消化系統(tǒng)功能。

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