羥基蛋氨酸鈷螯合物穩(wěn)定常數(shù)測定及其質(zhì)量評價

馬 麗蓋利剛李 寧李 梅

(1.山東輕工業(yè)學院化學與制藥工程學院，山東濟南 250353；2.青島寶博生物科技有限公司，山東青島 266100)

在動物飼料和預混料產(chǎn)品中，羥基蛋氨酸可以等摩爾地轉(zhuǎn)變成L-蛋氨酸；換言之，等摩爾的羥基蛋氨酸和D,L-蛋氨酸具有相同的生物學效價[1-2]。蛋氨酸是動物生長發(fā)育所必需的氨基酸，動物缺乏蛋氨酸會引起發(fā)育不良、體重減輕、肝腎機能減弱、肌肉萎縮、皮毛變質(zhì)等[2-3]。鈷是動物體內(nèi)所必需的微量元素，是維生素B12極其重要的組成成分；鈷可影響甲狀腺代謝，能參與膽堿、蛋氨酸等的合成及脂肪與糖的代謝；鈷還與其它微量元素（如鋅、銅、錳等元素）有協(xié)同作用，能促進這些微量元素在動物體內(nèi)的吸收[4-5]。鈷作為中心離子能與羥基蛋氨酸螯合成羥基蛋氨酸鈷，但這種新型的有機微量元素添加劑到目前為止鮮有報道[6-7]。

近來，我們實驗室以價廉、低毒的醇水溶液為介質(zhì)，以市售羥基蛋氨酸和氫氧化鈷為原料，制得了羥基蛋氨酸鈷，并對其進行了物相分析、形貌觀測、表面元素分析及熱穩(wěn)定性考察[8]。有機微量元素螯合物的配位數(shù)和穩(wěn)定常數(shù)是影響其生物學利用率的重要指標[9]，能夠為配合物結構的確定提供重要的信息；但是，由于羥基蛋氨酸微量元素螯合物的單晶很難培養(yǎng)，關于羥基蛋氨酸螯合物的化學結構到目前為止還沒有可靠的數(shù)據(jù)，只能靠推測。本文采用分光光度法測定了羥基蛋氨酸鈷樣品的配位數(shù)和穩(wěn)定常數(shù)，為合理推測其結構及評價其穩(wěn)定性提供了依據(jù)。其次，采用自動電位滴定分析儀測定了樣品中羥基蛋氨酸及羥基蛋氨酸鈷的含量，對樣品的質(zhì)量進行了評價。本文的研究旨在為市場上同類產(chǎn)品的質(zhì)量評價提供技術參考。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

化學試劑：氫氧化鈉、鄰苯二甲酸氫鉀、六水合氯化鈷(Ⅱ)、冰乙酸、濃鹽酸(36%～38%)、五水合硫代硫酸鈉、無水碳酸鈉、重鉻酸鉀、碘化鉀、濃硫酸、可溶性淀粉、溴酸鉀、溴化鉀、酚酞，以上試劑均為分析純。市售88%的羥基蛋氨酸（MHA）由日本住友化學有限公司北方辦事處提供。

實驗儀器：KQ-700E型超聲波清洗器（上海精密科學儀器有限公司生產(chǎn)），ZDJ-4A型自動電位滴定儀（上海永亨光學儀器制造有限公司生產(chǎn)），81-2型恒溫磁力攪拌器（上海司樂儀器有限公司生產(chǎn)），DZF-6050型真空干燥箱（上海凱朗儀器設備廠生產(chǎn)），ESJ210-4A電子天平（上海先悅衡器設備有限公司生產(chǎn)），UV754A型紫外可見分光光度計（上海精密科學儀器有限公司生產(chǎn)）。

1.2 實驗原理

1.2.1 羥基蛋氨酸鈷穩(wěn)定常數(shù)的測定

采用等摩爾數(shù)連續(xù)變化法（也叫濃比遞變法或Job法）測定羥基蛋氨酸鈷樣品的穩(wěn)定常數(shù)[10]。在保持溶液中金屬離子濃度(cM)與配體濃度(cL)之和不變的前提下，改變cM和cL的相對量，配制一系列溶液。只有當溶液中金屬離子與配體物質(zhì)的量之比與配合物的組成一致時，配合物的濃度最大。用分光光度計測定上述一系列溶液的吸光值，以吸光值(A)為縱坐標，以摩爾分數(shù)(F)為橫坐標作圖，得吸光曲線。將曲線兩邊的直線部分延長相交，根據(jù)交點對應的橫坐標值即可求出配合物MLn中配位體的數(shù)目n。

根據(jù)配合物離解平衡方程式（MLn=M+nL）和配合物的離解度(α)可確定表觀穩(wěn)定常數(shù)

1.2.2 羥基蛋氨酸及羥基蛋氨酸鈷含量的測定

利用溴酸鉀-溴化鉀法[2,10-11]測定樣品中羥基蛋氨酸的含量，并進而計算出樣品中羥基蛋氨酸鈷的含量。在酸性介質(zhì)中，羥基蛋氨酸鈷分解形成鈷離子和羥基蛋氨酸陰離子。羥基蛋氨酸陰離子和溴酸鉀-溴化鉀標準溶液發(fā)生如下反應,見式(1)和(2)：

進行電位滴定時，在待測液中插入一根鉑和飽和甘汞電極組成的復合電極。隨著KBrO3/KBr滴定液的加入，待測組分濃度不斷變化，電極電位也發(fā)生相應的變化，在等電點附近發(fā)生電位突躍，以此確定滴定終點。

1.3 實驗步驟

1.3.1 羥基蛋氨酸鈷穩(wěn)定常數(shù)的測定

1.3.1.1 羥基蛋氨酸水溶液的標定

稱取約 8.6 g（精確至0.1 mg）市售羥基蛋氨酸，并將之全部轉(zhuǎn)移至1 000 ml容量瓶中，用除去CO2的蒸餾水稀釋、定容、搖勻；移取50 ml羥基蛋氨酸水溶液，加入2滴1%的酚酞指示劑，用按國標GB/T 601—2002規(guī)定的方法標定的NaOH標準溶液(0.091 8 mol/l)滴定至溶液由無色變?yōu)榉奂t色，并在30 s內(nèi)不褪色。平行滴定三次并做空白實驗。

1.3.1.2 吸光值的測定

配制與步驟1中羥基蛋氨酸水溶液濃度相同的氯化鈷(Ⅱ)水溶液。按表1所示的體積比配制一系列混合溶液，分別用步驟1中的NaOH標準溶液調(diào)溶液的pH值約為6.5，然后稀釋至60 ml；在85°C將混合溶液加熱回流2 h，冷卻至室溫，測其290 nm處的吸光值。

1.3.2 羥基蛋氨酸及羥基蛋氨酸鈷含量的測定

按國標GB/T 21034—2007規(guī)定的方法測定。稱取約0.5 g（精確至0.1 mg）干燥的羥基蛋氨酸鈷樣品，置于100 ml燒杯中，加入50 ml混酸溶液(冰乙酸：水：濃鹽酸=50：10：3，體積比)，超聲溶解后將燒杯置于磁力攪拌器上。將電極插入溶液中，調(diào)節(jié)攪拌速率至溶液平穩(wěn)渦旋，用按國標GB/T 601—2002規(guī)定的方法標定的溴酸鉀-溴化鉀標準溶液（0.105 1 mol/l）滴定。當電位出現(xiàn)變化時，減慢滴定速率，當電位值發(fā)生突躍時，即為滴定終點，記錄滴定溶液的體積。平行滴定三次。

3 結果與討論

3.1 羥基蛋氨酸鈷配位數(shù)及穩(wěn)定常數(shù)的確定

經(jīng)測定，羥基蛋氨酸水溶液的濃度為0.044 3 mol/l；因此，準確稱取1.581 0 g六水合氯化鈷(II)，并將之溶解于150 ml除去CO2的蒸餾水中，以使配體溶液的濃度和金屬離子溶液的濃度相等。對序號為5的溶液進行全波長掃描(200～800 nm)，確定出最佳吸收峰出現(xiàn)在290 nm處，依次對所有溶液進行290 nm的單波長掃描，記錄不同體積分數(shù)溶液的吸光值(見表1)。以吸光值為縱坐標，溶液中金屬離子的摩爾分數(shù){c(M)/[c(M)+c(L)]}為橫坐標作圖，得吸光曲線圖(見圖1)。

表1 配合物溶液配制及吸光值

由圖1可以看出，吸光曲線兩邊直線部分延長相交于B點，B點對應金屬離子的質(zhì)量分數(shù)為0.355，即：c(M)/[c(M)+c(L)]=0.355，則：c(L)/c(M)=1.82≈ 2?？紤]到羥基蛋氨酸根離子中α-羥基和羧酸根中的氧可與鈷(II)離子形成穩(wěn)定的五元環(huán)螯合物，則羥基蛋氨酸鈷螯合物的配位數(shù)為4，這說明我們所推測的羥基蛋氨酸鈷的結構式是合理的[8]。

直線BC與吸光曲線相交于D點，由此可確定配合物的離解度α=(0.293-0.259)/0.293=0.116。B點對應的配合物濃度c=0.0443×0.355×20/60=5.24×10-3mol/l，則配合物的表觀穩(wěn)定常數(shù)為[(2×5.24×10-3)1.82×0.1162.82]=4.71×105.46。

配合物穩(wěn)定常數(shù)測定的儀器分析方法主要有電化學法、分光光度法、色譜法和毛細管電泳法等，各種方法各有優(yōu)缺點。其中，分光光度法和電位法相比，雖然準確性較差，但具有操作方便、檢測迅速、溶液選擇的范圍廣等優(yōu)點[12]。雖然羥基蛋氨酸鈷在蒸餾水中的溶解度較小，室溫下約為0.8 g；實驗結果表明，只要控制配合物溶液的濃度小于2.24×10-2mol/l，采用分光光度法測定羥基蛋氨鈷螯合物的穩(wěn)定常數(shù)是可行的。

3.2 羥基蛋氨酸和羥基蛋氨酸鈷含量的測定

表2是采用自動電位滴定儀測定的羥基蛋氨酸鈷樣品中MHA含量實驗數(shù)據(jù)表。根據(jù)反應式(1)和(2)可以確定樣品中MHA的質(zhì)量百分含量其中，c為KBrO3-KBr標準溶液的濃度(0.105 1 mol/l)，M1為羥基蛋氨酸的摩爾質(zhì)量(150.2)。由表2可見，樣品中MHA的平均質(zhì)量百分含量為83.20%，且偏差均小于0.5%，說明采用溶劑熱法所制備的羥基蛋氨酸鈷遠比采用水熱法所得的產(chǎn)物質(zhì)量高[8,13]。

表2 樣品中羥基蛋氨酸含量實驗數(shù)據(jù)

表3是樣品中羥基蛋氨酸鈷含量實驗測定數(shù)據(jù)表。根據(jù)反應式(1)和(2)及上述羥基蛋氨酸鈷配位數(shù)的計算結果，可以確定樣品中羥基蛋氨酸鈷的質(zhì)量百分含量，其中，M2為羥基蛋氨酸鈷的摩爾質(zhì)量(357.33)。由表3可見，樣品中羥基蛋氨酸鈷的平均含量高達98.97%，且各種偏差均小于0.5%。結合表2的實驗數(shù)據(jù)，充分說明采用溶劑熱法能夠制得高質(zhì)量的羥基蛋氨酸鈷。

表3 樣品中羥基蛋氨酸鈷含量實驗數(shù)據(jù)

4 結論

采用分光光度法測定了羥基蛋氨酸鈷樣品的表觀穩(wěn)定常數(shù)，采用自動電位滴定法測定了樣品中羥基蛋氨酸及羥基蛋氨酸鈷的含量。研究結果表明：羥基蛋氨酸鈷樣品的表觀穩(wěn)定常數(shù)為4.71×105.46，樣品中羥基蛋氨酸的含量為83.20%，羥基蛋氨酸鈷的含量為98.97%，結合分光光度法和自動電位滴定法對羥基蛋氨酸類似物進行質(zhì)量評價，方法簡單，操作方便，實驗數(shù)據(jù)誤差小、重現(xiàn)性好，可以作為同類產(chǎn)品生產(chǎn)企業(yè)日常質(zhì)量檢驗的技術參考。

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