不同劑量鉬對小尾寒羊組織病理變化及抗氧化功能影響

程才才 楊自軍

(河南科技大學(xué)動物科技學(xué)院，河南洛陽 471003)

鉬是黃嘌呤氧化酶、醛氧化酶和亞硫酸鹽氧化酶等多種酶的輔助因子，對機體代謝和有害物質(zhì)的清除有重要作用[1]。鉬能提高飼料利用率，促進動物生長，還可提高畜禽繁殖性能、生產(chǎn)性能及成活率[2]。隨著鉬添加劑的廣泛應(yīng)用和鉬礦的大量開采，鉬中毒事例日益增加。例如1981年發(fā)生于日本島根縣牛的“毛白化病”，Hallgren報道1954年瑞典牧場放牧牛群發(fā)生“腹瀉病”，以及發(fā)生于我國贛南大余縣耕牛的“紅皮白毛癥”和陜西南洛河流域流行多年的耕?！昂谒埂钡?，均是由于食物中鉬含量過高引起的。豫西地區(qū)是富鉬地區(qū)，鉬中毒事例時有發(fā)生。本研究選取小尾寒羊為研究對象，通過在飼糧中添加不同劑量的鉬，最終觀察鉬劑量對綿羊病理組織學(xué)和抗氧化機能的影響，為鉬中毒機理的探討和臨床防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

18只2月齡健康、大小勻稱[(20±1.34)kg]的小尾寒羊公羊(購于洛陽市郊區(qū)種羊場)，隨機分為3組，因加鉬量的多少分為Ⅰ組[60 mg/(kgBW·d)]、Ⅱ組[30 mg/(kgBW·d)]、Ⅲ組[0 mg/(kgBW·d)]。加鉬所用藥品為Na2MoO4·2H2O(分析純，天津市化學(xué)試劑四廠，批號20101024)，藥品溶于水中按體重灌服（早晨空腹）。飼喂相同基礎(chǔ)日糧，日糧配方及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)日糧配方及營養(yǎng)水平

1.2 試驗方法

1.2.1 臨床癥狀觀察

試驗羊集體驅(qū)蟲，飼喂相同基礎(chǔ)日糧，適應(yīng)15 d后開始攻鉬，然后每天觀察各組羊的飲食欲、精神狀態(tài)、運步、皮膚被毛、口腔黏膜、二便以及對體溫、脈搏、心跳進行記錄，每隔7 d稱重一次，并進行記錄。

1.2.2 病理組織學(xué)觀察

試驗第60 d，選取鉬中毒典型癥狀試驗羊進行宰殺，立即采取相應(yīng)組織放入10%甲醛中固定，進行常規(guī)HE染色，具體操作方法參見文獻[3]。

1.2.3 抗氧化指標測定

攻鉬首天頸靜脈采集血液10 ml,分離血清，-20℃溫度下保存待測。XOD、GSH-Px、SOD、MDA抗氧化指標用試劑盒測定（購于南京建成生物工程研究所）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)均以平均值±標準差表示。應(yīng)用Spss17.0統(tǒng)計分析軟件對各組數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，用Duncan's法多重比較法對各組數(shù)據(jù)進行差異顯著性比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床癥狀觀察

0～8 d各組試驗羊均未出現(xiàn)明顯臨床變化，8～10 dⅠ組個別羊出現(xiàn)精神倦怠，喜臥少動，食欲減退，晚上有叫喚和磨牙現(xiàn)象，15 d后Ⅱ組個別羊也出現(xiàn)類似現(xiàn)象，30 d左右Ⅰ、Ⅱ組羊均不同程度地出現(xiàn)上述臨床表現(xiàn)。40 d左右Ⅰ、Ⅱ組羊出現(xiàn)腹瀉軟成團糞便，個別羊拉稀便，同時兩組羊均出現(xiàn)黏膜蒼白、貧血、消瘦、體重減輕現(xiàn)象。60 d左右Ⅰ、Ⅱ組羊出現(xiàn)明顯被毛蓬松無光、掉毛，掉毛嚴重的背部露出大面積的皮膚，皮膚蒼白無彈性。個別羊出現(xiàn)長時間臥地不起，驅(qū)趕時勉強站立，走路蹣跚，70 d左右Ⅰ組出現(xiàn)羊只死亡現(xiàn)象。Ⅲ組羊無明顯臨床癥狀。

2.2 病理組織學(xué)觀察(見圖1)

2.3 抗氧化指標的變化

加鉬組血清XOD活性呈持續(xù)上升趨勢，后期差異極顯著(P＜0.01)，但加鉬組之間血清XOD活性無明顯差異(P＞0.05)，對照組血清XOD活性無明顯變化(P＞0.05)從30天開始，加鉬組血清XOD活性與對照組差異極顯著(P＜0.01)。加鉬組血清GSH-Px活性呈持續(xù)下降趨勢，且差異極顯著(P＜0.01)，對照組血清GSHPx活性無明顯變化(P＞0.05)；從15 d開始，各組之間在各個時間點血清GSH-Px活性差異極顯著 (P＜0.01)。加鉬組血清SOD活性呈持續(xù)下降趨勢，且差異極顯著(P＜0.01)，對照組血清SOD活性無明顯變化(P＞0.05)；從30 d開始，對照組和鉬30組血清SOD活性與鉬60組差異極顯著 (P＜0.01)，后期鉬30組血清SOD活性與對照組差異極顯著(P＜0.01)。加鉬組血清MDA濃度呈持續(xù)上升趨勢，且差異極顯著(P＜0.01)，對照組血清MDA濃度無明顯變化(P＞0.05)；從15 d開始，加鉬組血清MDA濃度與對照組差異極顯著，15 d時，鉬30組血清MDA濃度與鉬60組差異極顯著(P＜0.01)，30 d 時差異顯著 (P＜0.05)，45 和 60 d 時差異不顯著(P＞0.05)。

3 討論

3.1 不同劑量鉬對小尾寒羊臨床癥狀和組織病理變化的影響

本試驗中后期小尾寒羊均出現(xiàn)腹瀉、貧血、行動遲緩、被毛褪色、掉毛等典型鉬中毒癥狀，且Ⅰ組試驗羊出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。病理組織學(xué)觀察也發(fā)現(xiàn)，肝臟、脾臟、腎臟、心肌、睪丸均出現(xiàn)不同程度的病理變化，同時隨著鉬劑量的增加，組織病理學(xué)損傷越嚴重，而各組間肺臟、淋巴結(jié)無明顯病理變化，這與肖杰[4]和Tiffany[5]研究結(jié)果相似。鉬中毒時鉬主要是干擾體內(nèi)銅的吸收與代謝，進而影響含銅酶的活性，含銅酶在體內(nèi)分布廣泛，具有清除體內(nèi)自由基、維持細胞能量代謝、造血、促進骨膠原形成和黑色素的增加等作用[6]；同時，Tiffany等[5]研究發(fā)現(xiàn)，高鉬飼喂肉牛能夠引起血漿磷含量持續(xù)下降，進而影響骨骼代謝。也有文獻[7]指出，鉬中毒時，鉬酸鹽與兒茶酚胺形成復(fù)合物而降低了后者的抑菌作用，使胃腸細菌活動增多而產(chǎn)生腹瀉。上述作用機制很好地解釋了本試驗結(jié)果。

表2 不同劑量鉬對小尾寒羊血清相關(guān)酶學(xué)指標變化的影響

3.2 不同劑量鉬對小尾寒羊抗氧化功能的影響

動物機體有較完善的抗氧化系統(tǒng)，其中的一些酶類如谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）和超氧化物歧化酶（SOD）等，可以保護細胞不受氧化物和自由基的損害[8]，故GSH-Px和SOD的活性能反映機體的抗氧化功能。本試驗結(jié)果表明，血清中GSH-Px和SOD活性隨鉬劑量的升高而降低，且有明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，這與肖杰等[4]和張瑜等[9]研究結(jié)果相似。Cu是SOD和銅藍蛋白的輔助因子和調(diào)節(jié)因子，而高劑量的鉬能夠引起機體銅缺乏（動物中毒病學(xué)），進而引起SOD和銅藍蛋白活性的降低。而機體鉬中毒時，自由基大量堆積、細胞能量代謝障礙、造血功能受損等因素，也會影響抗氧化酶的生成和活性。

黃嘌呤氧化酶（XOD）是一種需氧脫氫酶類，它可以將黃嘌呤、次黃嘌呤氧化成尿酸，另外對醛類、嘧啶類、蝶啶類也有氧化作用[10]。本試驗結(jié)果表明，血清中XOD活性隨著鉬劑量的增加而降低，這與Cox等[11]和肖杰等[4]研究結(jié)果不一致，推測原因有：①本試驗以小尾寒羊為研究對象，而其研究對象分別為小鼠和雛雞，鉬中毒機理在不同種屬動物間有差異[12]；②試驗測定條件不一致。有文獻[13]表明，黃嘌呤氧化酶能夠催化黃嘌呤產(chǎn)生超氧陰離子自由基和一氧化氮自由基，同時，XOR來源的尿酸有抗氧化功能[14]。筆者分析認為，尿酸的抗氧化功能有限，而產(chǎn)生的自由基對機體的損害作用占主導(dǎo)作用，進而引起機體抗氧化功能的進一步降低。

丙二醛（MDA）是過氧化脂質(zhì)分解代謝的產(chǎn)物，與自由基產(chǎn)生量成正比。測定MDA含量可以反映出機體細胞受自由基攻擊和脂質(zhì)過氧化的程度，從而反映出細胞損傷的嚴重性[15]。本試驗中，血清MDA含量隨著鉬劑量的增加而升高，說明鉬中毒時，機體自由基大量產(chǎn)生，細胞損傷嚴重。

3.3 反芻動物鉬添加量與中毒劑量

不同種類的反芻動物對鉬的耐受性差異很大，奶牛與肉牛最敏感，其次是綿羊，山羊的耐受性較大。日糧中鉬劑量為25～50 mg/kg時，肉牛的生長發(fā)育和育肥效果沒有受到影響[16]，而摩弗倫綿羊的中毒水平為300 mg/kg,研究發(fā)現(xiàn)，山羊?qū)︺f的耐受量最高可達日糧的1 000 mg/kg，幾乎與雞和兔的耐受量相同[17]。按照美國 NRC(1994)標準，鉬添加劑量，奶牛、肉牛＜0.01 mg/kg，而綿羊、山羊＜0.05～1.0 mg/kg。試驗證明，飼料中鉬的最高允許量奶牛、肉牛為5 mg/kg，綿羊、山羊為10 mg/kg[18]。經(jīng)核算，整個試驗周期中，小尾寒羊的日攝食量為2 kg/d(干重)左右，平均體重為30 kg左右，飼料中鉬添加劑量達到了455.61 mg/kg和905.61 mg/kg,遠遠高于上述文獻中的最高允許量。

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