阿霉素對(duì)sw480細(xì)胞端粒酶活性的影響

孟永亮 孫彥 羅小玲

研究發(fā)現(xiàn)，蒽醌類藥物對(duì)許多實(shí)體腫瘤顯示出良好的療效[1-3]。但此類藥物由于誘發(fā)腫瘤耐藥的特性及對(duì)細(xì)胞的毒副作用使其臨床上的應(yīng)用受到限制[4]。其中，阿霉素仍然是研究蒽醌類抗腫瘤藥物作用機(jī)理及觀察蒽醌類藥物臨床療效的代表性藥物，它可抑制RNA 和DNA的合成，對(duì)RNA的抑制作用最強(qiáng)，抗瘤譜較廣[5,7-8]，有研究表明，阿霉素作為蒽醌類藥物的代表，它可誘導(dǎo)含端粒重復(fù)序列的核苷酸形成分子內(nèi)G4結(jié)構(gòu)，抑制端粒的延伸反應(yīng)，還可保護(hù)端粒重復(fù)序列中鳥嘌呤免遭甲基化[5-6]。

1 材料和方法

1.1 材料 大腸癌SW480細(xì)胞系購自上海細(xì)胞庫；鹽酸阿霉素（上海佳倫生物科技有限公司，批號(hào)922008）；端粒酶活性檢測(cè)試劑盒（德國(guó)Roche公司）；MTT（AMRESCO）；L15培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）；新生小牛血清（杭州四季青生物工程材料公司）；二甲基亞砜（美國(guó)Sigma公司）；其它常規(guī)試劑和儀器（廣西醫(yī)科大學(xué)腫瘤學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東萬杰醫(yī)學(xué)院生物工程省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）。

1.2 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱（Heal Force）；熒光顯微鏡（奧林巴斯）；倒置顯微鏡（奧林巴斯）；PCR擴(kuò)增儀（bio-rad）全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)SHELLAB）。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 飽和濕度條件下的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)傳代培養(yǎng)sw480細(xì)胞，傳代比例1:3。

1.4 細(xì)胞毒性測(cè)定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的sw480細(xì)胞制成2×104細(xì)胞懸液，取100μl接種于96孔培養(yǎng)皿內(nèi),使阿霉素濃度分別達(dá)到2.5、5.0、10、20μmol/l,培養(yǎng)24、48、72、96h后，每孔加入MTT液20ul，再培養(yǎng)4h，去上清，加入二甲基亞砜。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上，測(cè)定490nm處的光密度吸收值，計(jì)算不同濃度阿霉素對(duì)SW480細(xì)胞的增殖抑制率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，計(jì)算平均值。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇經(jīng)阿霉素作用72小時(shí)后細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率在50%以下的最小作用濃度作為隨后的作用濃度，防止因阿霉素細(xì)胞毒作用過大而干擾觀測(cè)其對(duì)sw480細(xì)胞端粒酶活性的影響。

1.5 PCR-TRAT-Elisa端粒酶活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)大腸癌sw480細(xì)胞端粒酶活性常規(guī)方法提取經(jīng)阿霉素處理不同時(shí)間的（24，48，72，96h）的細(xì)胞，0.25%胰酶消化細(xì)胞，各取2×105個(gè)細(xì)胞移入EP管。4℃1000rpm離心10min，棄上清，加入裂解液裂解。16000轉(zhuǎn)/min離心，4℃，30分鐘，取上清，測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，調(diào)正為5mg/ml，取待測(cè)蛋白50μg(總蛋白)，進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件如下：

取5μl擴(kuò)增產(chǎn)物，加入20μl變性試劑，25℃孵育10分鐘，再加入225μl雜交緩沖液，振蕩混勻后取100μl混合物加入已包被微孔板的孔中，37℃，300pm振蕩2小時(shí)，棄去雜交液，用清洗緩沖洗三次，加入抗DIG-POD工作液100μl,25℃，30分鐘，再用清洗緩沖液洗五次，加入TMB底物溶液100μl,20分鐘后再加入100μl終止液終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀測(cè)定結(jié)果A450nm、A630nm的吸光度值（A值）。

陽性結(jié)果判斷：陽性對(duì)照為sw480細(xì)胞，陰性標(biāo)本經(jīng)65℃、加熱30min滅活端粒酶后作為陰性對(duì)照。陽性對(duì)照吸光度應(yīng)大于1.5，陰性對(duì)照吸光度應(yīng)小于0.25，待測(cè)標(biāo)本⊿A＝標(biāo)本吸光度A值－陰性對(duì)照吸光度A值，若標(biāo)本A＞0.2，即為端粒酶陽性。

2 結(jié)果

2.1 阿霉素抑制sw480細(xì)胞增殖的量效及時(shí)效關(guān)系

MTT結(jié)果顯示，阿霉素抑制SW480細(xì)胞增殖具有濃度和時(shí)間依賴性，即藥物作用濃度越大，作用時(shí)間越長(zhǎng)，其對(duì)細(xì)胞的抑制作用最明顯，阿霉素作用72h后，2.5μmol/L和5.0μmol/L阿霉素的生長(zhǎng)抑制率在50%以下，而10μmol/L、20μmol/L的阿霉素生長(zhǎng)抑制率在50%～100%之間（圖1），依據(jù)此MTT結(jié)果，本研究選擇5μmol/L作為隨后實(shí)驗(yàn)的作用濃度，作用時(shí)間72h。

圖1 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖結(jié)果

2.2 各組細(xì)胞的端粒酶活性情況

隨處理時(shí)間延長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞端粒酶活性逐漸降低，72h后達(dá)到最低（P＞0.05）；見表1，圖2。

表1 加藥不同時(shí)間點(diǎn)各組端粒酶活性比較（±s,n=3）

表1 加藥不同時(shí)間點(diǎn)各組端粒酶活性比較（±s,n=3）

注：a與其他組比較

A值空白對(duì)照組 2.11±0.147加藥24h組 1.96±0.126加藥48h組 1.83±0.108加藥72h組 1.65±0.137a加藥96h組 1.62±0.145a組別

圖2 加藥不同時(shí)間點(diǎn)各組端粒酶活性比較

3 討論

阿霉素的細(xì)胞吸收和細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)已在一系列人腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞系內(nèi)進(jìn)行[5-6,9]，為避免嚴(yán)重細(xì)胞毒作用對(duì)細(xì)胞端粒酶活性檢測(cè)的干擾，便于觀察其生物學(xué)性狀變化，本研究首先進(jìn)行了阿霉素細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，依據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定了5μmol/L阿霉素作為本研究的實(shí)驗(yàn)作用濃度。在TRAP檢測(cè)中，上述作用濃度的阿霉素對(duì)sw480細(xì)胞端粒酶介導(dǎo)的端粒延伸反應(yīng)有明顯抑制作用。說明5μmol/L是較合適的實(shí)驗(yàn)作用濃度，不會(huì)產(chǎn)生過大的細(xì)胞毒作用，在抑制細(xì)胞增殖的同時(shí)，可以對(duì)其端粒酶活性產(chǎn)生抑制作用。

本部分實(shí)驗(yàn)旨在針對(duì)人大腸癌sw480細(xì)胞株單獨(dú)給予阿霉素，檢測(cè)在阿霉素單獨(dú)作用下細(xì)胞的增殖情況，檢測(cè)sw480細(xì)胞內(nèi)靶基因hTERT和端粒酶表達(dá)的變化，為以后研究綜合研究阿霉素在促進(jìn)G-四鏈體形成，穩(wěn)定端粒，抑制腫瘤細(xì)胞增殖方面存在的潛力奠定研究基礎(chǔ)。

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