膽管癌組織中Ezrin蛋白表達水平及其臨床價值

李紹軍 劉小方 (青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬煙臺毓璜頂醫(yī)院肝膽胰外科，山東 煙臺 264000)

膽管癌或膽管細胞癌是起源于膽道上皮細胞的惡性腫瘤，發(fā)病率約占肝膽系統(tǒng)惡性腫瘤的15%〔1～3〕。尋找有效的腫瘤標(biāo)志物不但可以早期診斷和對預(yù)后進行判斷，也對尋找有效治療靶點提供有益的參考。Ezrin蛋白是細胞骨架的主要成員，對腫瘤細胞的作用主要是參與控制細胞的形態(tài)、黏附、運動及為細胞的增殖和生存轉(zhuǎn)換生長信號。近年來發(fā)現(xiàn)Ezrin蛋白的過表達與多種腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移有關(guān)〔4～8〕，但在膽管癌中的系統(tǒng)研究尚未見報道。本研究探討膽管癌Ezrin蛋白表達變化以及其與腫瘤分期、轉(zhuǎn)移的關(guān)系，旨在探討Ezrin蛋白在膽管癌發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 煙臺毓璜頂醫(yī)院肝膽外科2007年7月至2010年7月收治的有完整資料記載的膽管癌標(biāo)本38例，排除二次手術(shù)，可供使用的標(biāo)本30例;同時選取10例良性膽管疾病作為對照。所有標(biāo)本資料詳實，術(shù)前都未接受放療與化療。30例膽管癌標(biāo)本中女12例，男18例;年齡37～74〔平均(57.2±14.7)〕歲;按照2002年美國癌癥聯(lián)合委員會(AJCC)公布的膽管癌分期方案，Ⅰ/Ⅱ期者11例，Ⅲ/Ⅳ期者19例;病理證實有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移17例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移13例。兔抗人Ezrin單克隆抗體:Bioworld公司;生物素-過氧化物酶復(fù)合物(SP)免疫組化染色試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒:福州邁新生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法 所有標(biāo)本均術(shù)后立即取材，放入4%中性甲醛中固定24 h，石蠟包埋，切取4 μm厚度切片1張，用于免疫組織化學(xué)染色，按SP免疫組化試劑盒說明書進行。

1.3 結(jié)果判定標(biāo)準 染色細胞內(nèi)出現(xiàn)棕色顆粒為陽性表達。Ezrin在癌組織中主要在胞質(zhì)中表達。選取每張病理切片至少10個不同的視野在高倍鏡下(250倍)觀察，以此來判斷細胞染色強度與著色率。染色結(jié)果半定量分析:以染色強度結(jié)合陽性細胞數(shù)百分比綜合計分，組織切片中胞質(zhì)染為淡黃色至棕褐色者為陽性細胞標(biāo)志。染色強度以多數(shù)細胞呈現(xiàn)的染色特性(染色深淺需與背景著色相對比)計分:無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細胞百分比即某類細胞5個視野(每250倍視野計數(shù)100個此類細胞)的陽性細胞平均數(shù):0～5%為0分，6% ～25%為1分，26% ～50%為2分，51% ～75%為3分，＞75%為4分。每張切片隨機取5個250倍視野，每個視野均進行染色強度計分與陽性細胞百分比計分，染色強度與陽性細胞百分比的乘積:0分為陰性(－)，1～6分為弱陽性，7～12分為強陽性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0軟件行χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 Ezrin蛋白在膽管癌組織及良性膽管組織中的表達Ezrin蛋白在膽管癌組織及良性膽管組織中均有不同程度的表達，主要表達以細胞質(zhì)和細胞膜為主，良性組織中，陽性表達率60.0%(弱陽性5例，強陽性1例)，評價得分3.1。膽管癌陽性表達率90%(弱陽性7例，強陽性20例)，平均得分6.96。經(jīng)統(tǒng)計分析后發(fā)現(xiàn)，膽管癌組織中Ezrin蛋白的表達與良性膽管組織比較有顯著性差異(P＜0.01)。見圖1。

2.2 膽管癌中Ezrin蛋白的表達與臨床病理特征的關(guān)系 Ⅰ/Ⅱ期11例膽管癌患者中陽性表達9例(82%，弱陽性5例，強陽性4例)，平均得分4.64;Ⅲ/Ⅳ期19例膽管癌患者中，陽性表達18例(95%，弱陽性2例，強陽性16例)，平均得分8.32，Ezrin蛋白在Ⅰ/Ⅱ期和Ⅲ/Ⅳ期膽管癌患者中的陽性表達強度有顯著差異(P＜0.05)。17例伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者Ezrin蛋白陽性表達率94%(弱陽性1例，強陽性15例)，評價得分9.11;沒有轉(zhuǎn)移的陽性表達率85%(弱陽性6例，強陽性5例)，平均得分4.09，經(jīng)統(tǒng)計分析差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見圖2。

圖1 Ezrin蛋白在膽管癌中的表達

圖2 Ezrin蛋白表達與臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系(×250)

3 討論

在影響影響膽管癌預(yù)后幾個因素中最關(guān)鍵是腫瘤的浸潤與轉(zhuǎn)移。膽管癌的侵襲、轉(zhuǎn)移是多基因參與、多步驟完成的復(fù)雜過程，其中腫瘤細胞黏附能力及運動能力的改變，腫瘤細胞與細胞外基質(zhì)間的相互作用是腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)，也是腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)〔4，5〕。探討影響這些關(guān)鍵環(huán)節(jié)的調(diào)控因素將有助于更深入地理解膽管癌浸潤和轉(zhuǎn)移的機制。

Ezrin蛋白是一種將細胞骨架與細胞膜連接起來的蛋白質(zhì)，于1981年首次發(fā)現(xiàn)，是埃絲蛋白-根蛋白-膜突蛋白(ERM)蛋白家族的一員〔5，6〕。Ezrin蛋白表達具有相對的組織和細胞特異性，在正常組織主要集中在富含肌動蛋白的細胞表面，在維持細胞形態(tài)和生存方面起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)Ezrin蛋白與腫瘤轉(zhuǎn)移之間有密切聯(lián)系:在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中Ezrin蛋白表達水平也明顯高于良性病變，而且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移正相關(guān);伴有Ezrin蛋白過表達的卵巢癌細胞具有高轉(zhuǎn)移潛能，而且預(yù)后差。通過siRNA對卵巢癌的Ezrin蛋白進行沉默可以顯著降低腫瘤細胞的侵襲能力;Ezrin蛋白表達水平高的食管癌發(fā)生惡性轉(zhuǎn)移的能力明顯高于Ezrin蛋白表達水平低的腫瘤細胞，而且容易在內(nèi)臟和軟組織中形成腫瘤團塊〔7～10〕。

在本研究中，膽管癌組織中的Ezrin蛋白表達明顯高于正常膽管組織，說明在膽管癌的發(fā)病過程中，Ezrin蛋白發(fā)生了表達差異變化。在病理分期表達差異研究中，惡性程度高的Ⅲ/Ⅳ期膽管癌的表達明顯高于Ⅰ/Ⅱ期的惡性程度比較低的膽管癌組織，而且發(fā)生轉(zhuǎn)移的膽管癌組織的表達率明顯高于尚未發(fā)生轉(zhuǎn)移的膽管癌組織。說明Ezrin蛋白在膽管癌的惡性變和浸潤轉(zhuǎn)移過程中具有一定的作用。

本次研究結(jié)果說明Ezrin蛋白可作為檢測膽管細胞癌程度、病理分期和預(yù)后的重要參考指標(biāo)。但E-cadherin和Ezrin蛋白在膽管癌發(fā)生、惡變以及轉(zhuǎn)移過程中，是直接作用于腫瘤細胞還是通過其他蛋白質(zhì)進行作用以及其中的信號通路等研究尚未涉及，有待進一步研究。

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