高效液相色譜與共振散射光聯(lián)用方法測定家兔血漿中阿米卡星的含量＊

周 卿，周旭美，楊 杰，陳芳路

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院藥物分析教研室，貴州 遵義 563099;2.遵義醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院08級學(xué)生，貴州 遵義563099)

阿米卡星(amikacin，AMK)是易溶于水的第三代半合成氨基糖苷類抗生素，具抗感染作用，是臨床常用強效廣譜抗生素。它的優(yōu)點在于耐藥性低和抗菌效率高，但其具有一定的腎毒性和耳毒性，臨床上應(yīng)用時應(yīng)盡可能進行血藥濃度監(jiān)測。但阿米卡星無特征紫外吸收基團，文獻［1～4］多采用微生物法、經(jīng)柱前衍生的高效液相色譜法或HPLCELSD 方法，目前也有報道采用 HPLC － RSL［5，6］聯(lián)用方法檢測阿米卡星制劑中的含量，但體內(nèi)樣品研究未有報道，本論文研究采用HPLC－RSL聯(lián)用方法檢測家兔血漿中阿米卡星的含量，方法靈敏度高，選擇性好，專屬性強，適用于阿米卡星在生物體內(nèi)藥物濃度的檢測。

1 儀器與試劑

Agilent 1100全自動高效液相色譜儀(包括G1311A四元泵，G1311A四元泵，G1321A熒光檢測器，美國安捷倫公司)，VARIAN Cary Eclipse熒光分光光度計(美國瓦里安公司)，TGL16M臺式高速冷凍離心機(長沙邁佳森儀器設(shè)備有限公司)，家兔購于遵義醫(yī)學(xué)院動物飼養(yǎng)中心。

阿米卡星標(biāo)準(zhǔn)品(批號:130335－200204，中國藥品生物制品檢定所)，阿米卡星注射液(天津藥業(yè)焦作有限公司)，達旦黃(國藥集團化學(xué)試劑廠)，甲醇和乙腈均為色譜純(德國迪瑪有限公司)，其他試劑為分析純，實驗所用水為重蒸水。

2 方法

2.1 HPLC－RSL聯(lián)用方法原理及裝置 在普通熒光分光光度計上測定分析物和探針溶液所形成離子締合物的共振散射光光譜，確定共振波長。樣品的分離在高效液相色譜儀上完成，另增加一個高壓泵用于在色譜柱后輸入探針溶液，被分離后的樣品溶液和探針溶液在柱后三通閥中混勻后進入反應(yīng)管，發(fā)生離子締合反應(yīng)，產(chǎn)生的RSL光譜由熒光檢測器在線檢測。

2.2 色譜條件 色譜柱為Agilent ZORBAX SBC18(4.6 ×250 mm，5 μm)，流動相為水:乙腈 =97∶3(V/V)，流速為 0.5 mL/min，λex= λem=488 nm，柱溫為25.0℃;探針達旦黃為20 μg/mL 的BR溶液(pH=4.56)，探針流速為 0.21 mL/min，柱后反應(yīng)管長為150 cm，內(nèi)徑為0.5 mm。

2.3 溶液的配制

2.3.1 BR 緩沖溶液的配制 BR(Britton－Robison)緩沖溶液由0.02mol/mLNaOH溶液與0.04 mol/mL硼酸，磷酸，冰乙酸溶液按一定比例混合，配成pH=4.56的緩沖溶液。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制精密稱取阿米卡星標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg，用重蒸水溶解定容至10 mL的容量瓶中，得到濃度為1.0 mg/mL的儲備液，并于4℃的冰箱中保存，臨用前用BR緩沖液稀釋至所需濃度。

2.3.3 TY－BR溶液的配制 精密稱取達旦黃(Titan Yellow，TY)0.0100g，用 BR 緩沖溶液定容至500mL的容量瓶中，得到達旦黃濃度為20μg/mL的BR溶液。

2.4 血漿樣品預(yù)處理方法 家兔經(jīng)頸靜脈取血1 mL于加入抗凝劑的采血管中，低速離心10 min(3500 r/min)，移取500μl上清液于空白離心管中，加入等體積乙腈，渦旋混勻，高速離心10 min(12 000 r/min，4℃)，取上層清液經(jīng)N2氣吹干后，用500 μlBR 緩沖液溶解，經(jīng) 0.45 μm 濾膜過濾后進樣 20 μl。

3 結(jié)果

3.1 方法專屬性 空白血漿、阿米卡星加空白血漿、家兔服藥后血漿經(jīng)“2.4”項下方法處理后進樣分析得到的色譜圖見圖1。在選定的色譜條件下，阿米卡星的保留時間約為4.2 min，血漿中內(nèi)源性雜質(zhì)對測定無干擾。

3.2 線性關(guān)系及定量限 分別于0.5 mL兔空白血漿中加入不同量的阿米卡星標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“血漿樣品預(yù)處理”項處理，以峰面積Y對血漿濃度C進行線性回歸。線性方程為Y=3.02×c+42.16，r=0.9992，結(jié)果表明，阿米卡星血漿濃度在10～600 μg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。血漿樣品可進行定量檢測的最低濃度為5.0 μg/mL(S/N=3)。

3.3 回收率和精密度試驗 提取回收率:配制含阿米卡星高、中、低3 種濃度為 50、250、500 μg/mL血漿樣品各5份，按2.4項下方法操作，進樣20 μl;另配制相同濃度的阿米卡星標(biāo)準(zhǔn)溶液，按相同量進樣，分別記錄峰面積，以血漿樣品測定峰面積與標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積的比值計算提取回收率，結(jié)果均在90%以上，結(jié)果(見表1)。

3.4 相對回收率及精密度 配制含阿米卡星高、中、低 3 種濃度為 50、250、500 μg/mL 血漿樣品各5份，按2.4項下方法操作，分別在同1 d內(nèi)測定5次，按回歸方程計算濃度。以測定值與加入值的比值計算相對回收率，并計算日內(nèi)精密度，對上述樣品連續(xù)測定5d，考察方法日間精密度，結(jié)果相對回收率在90%以上，日內(nèi)日間變異系數(shù)小于10%，結(jié)果(見表1)。

表1 血漿中阿米卡星的回收率和精密度(±s，n=5)

表1 血漿中阿米卡星的回收率和精密度(±s，n=5)

C/μg·mL－1 Intra－day RSD/% Intra－day RSD/% Method recov 90.3 ±2.54 250 235.51 ±2.15 2.1 230.1 ±6.28 2.72 93.1 ±1.97 93.6 ±1.87 500 499.27 ±0.14 1.6 498.9 ±0.98 0.19 99.8 ±0.19 eries/% Extraction recoverier/%50 54.64 ±3.37 3.7 58.78 ±2.64 4.49 107.7 ±4.10 97.6 ±2.24

3.5 穩(wěn)定性試驗 用空白血漿配制含阿米卡星濃度為250 μg/mL的血漿樣品，在－20℃冰箱中放置，分別在0、4、8、12、16、20d 取樣，按上述方法測定，計算阿米卡星的濃度，結(jié)果樣品在冷凍條件下放置20d內(nèi)穩(wěn)定，RSD為4.67%。

3.6 方法應(yīng)用 取家兔5只，分別于實驗前禁食12 h，注射劑量按體重?fù)Q算為12.5 mg/kg，耳緣靜脈給藥，頸靜脈取血，依次按10 min、0.5 h、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h、16 h 各取血 1 mL 于加入抗凝劑的采血管中，按2.4項下方法處理，測定阿米卡星在兔血漿中的濃度，繪制平均血藥濃度－時間曲線，(見圖2)。結(jié)果經(jīng)3P97藥動學(xué)軟件計算出主要藥代動力學(xué)參數(shù)。結(jié)果顯示，家兔1次靜脈注射阿米卡星后的藥時曲線為二室模型，生物半衰期為 t1/2為1.11±0.308 h，曲線下面積 AUC 為1193.4 μg/mL·h，與文獻報道基本相符［5］。

圖2 兔血漿中阿米卡星的平均藥－時曲線(n=5)

3.7 TY－AMK的RSL光譜 由圖3可見，在一定酸度條件下，AMK與TY本身RSL很弱。AMK與TY形成離子締合物后，增強了RSL強度。最大峰位于λex=λem=488nm處，且隨著濃度的增大，AMK的濃度與RSL的強度呈一定的線性關(guān)系，可作為定量的依據(jù)。

圖3 AMK－TY體系的共振散射光譜圖

4 討論

4.1 RSL實驗條件的選擇 在考察AMK－TY的RSL體系時，體系酸度是重要的影響因素。實驗中，通過改變BR緩沖溶液的pH值來調(diào)節(jié)體系的酸度，考察了pH值在3.0～6.0范圍內(nèi)，AMK－TY形成離子締合物的共振光強度隨pH值的變化情況，結(jié)果顯示pH值在4.56～5.50范圍內(nèi)可產(chǎn)生較強的RSL強度，當(dāng)酸度過高時(pH≤4.0)，抑制了TY上－SO3H基團上H的離解，不利于離子締合反應(yīng);而當(dāng)酸度過低時(pH≥7.0)，由于AMK質(zhì)子化的H+離解，而使它的正電荷降低，也不利于離子締合物的形成，使得 RLS的強度減?。?］。此外考慮到樣品在進入HPLC后由于柱后反應(yīng)管長及流速的限制，AMK須與探針試劑在短時間內(nèi)形成穩(wěn)定的離子締合物，故在此部分實驗中，還考察了TY與AMK反應(yīng)時間及穩(wěn)定性，結(jié)果顯示AMK－TY可迅速反應(yīng)，穩(wěn)定時間1 h以上，可滿足HPLC－RSL方法的要求。

4.2 HPLC－RSL條件的優(yōu)化

4.2.1 流動相的選擇 在選擇流動相時，需充分考慮到在RSL反應(yīng)中，由于離子締合物具有較強的疏水性，從而與水形成界面，使得RSL強度顯著增強，如果溶劑中含有高濃度的有機溶劑將使這一界面消失，導(dǎo)致RSL強度顯著降低［8］，故在HPLC方法中選擇流動相時需注意有機相的比例。實驗中考察了甲醇 －水(1∶99 ～10∶90，v/v)，乙腈 － 水(1∶99 ～10∶90，v/v)兩種流動相體系，結(jié)果顯示采用甲醇－水作為流動相時，所得色譜峰峰形易展寬，基線呈鋸齒狀，噪音較大，而采用乙腈－水作為流動相時，色譜峰峰形良好，對稱性好，且基線平穩(wěn)，當(dāng)乙腈－水比例為3∶97(V/V)時，AMK在5min內(nèi)可被完全洗脫，故選擇流動相為乙腈－水(3∶97，V/V)。

4.2.2 流速對RSL反應(yīng)的影響在HPLC－RSL聯(lián)用技術(shù)中，流速對RSL反應(yīng)的影響有兩種，一種是HPLC的流速;一種是探針的流速。HPLC的流速主要用于控制流動相攜帶樣品在色譜柱上的作用行為，探針流速用于控制在色譜柱后加入的探針試劑的流速。流速過快，容易造成RSL反應(yīng)時間不夠，檢測濃度過低，流速過慢，容易造成峰展寬，故需要調(diào)節(jié)適宜的流速。在實驗中，調(diào)節(jié)流速時需同時兼顧兩種流速對樣品檢測的影響，否則容易造成嚴(yán)重的基線波動，經(jīng)實驗考查，最終確定HPLC 流速為0.5mL/min，探針流速為 0.21 mL/min，此條件下，可得到平穩(wěn)的基線及峰形良好的色譜峰。

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