肝復(fù)康對(duì)大鼠肝組織血小板衍生生長(zhǎng)因子表達(dá)及對(duì)膠原合成的影響*

李 驄 周 情 姜妙娜 張彩華 賈玉杰

血小板衍生生長(zhǎng)因子（platelet-derived growth factor，PDGF）是目前已知多肽生長(zhǎng)因子中對(duì)肝星狀細(xì)胞（HSC）作用最強(qiáng)的有絲分裂原[1-4]，在肝纖維化發(fā)生發(fā)展中起著非常重要的作用。我們觀察了肝復(fù)康對(duì)大鼠肝組織PDGF表達(dá)的影響。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞 健康SD大鼠（雌雄不限），體重180～220克，清潔級(jí)，由本校動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。HSC-T6細(xì)胞株由上海中醫(yī)藥大學(xué)肝病研究所徐列明教授惠贈(zèng)，表型為活化的HSCs。

二、藥物及含藥血清的制備 同前報(bào)道。

三、肝纖維化動(dòng)物模型的制備 隨機(jī)將大鼠分為正常對(duì)照組、模型組和肝復(fù)康治療組。在造模時(shí)，皮下注射以橄欖油稀釋的10%四氯化碳（5ml.kg-1），每周兩次，共12周。正常對(duì)照組以同樣方法皮下注射生理鹽水。其中肝復(fù)康治療組于造模第9周后開始用肝復(fù)康（溶于10ml/kg生理鹽水）312.5mg.kg-1.d-1灌胃至20周，而正常對(duì)照組和模型組則以等容量的生理鹽水灌胃。于21周末處死動(dòng)物，迅速取出肝組織，稱取肝臟濕重,置-70℃冰箱保存?zhèn)錂z。

四、HSC-T6細(xì)胞培養(yǎng) 將傳代培養(yǎng)的HSC按常規(guī)方法接種于6孔板中，分為正常對(duì)照組：加10%對(duì)照血清的DMEM；模型組：10%對(duì)照血清＋PDGF（終濃度60ng／ml）的DMEM；肝復(fù)康治療組：10%藥物血清＋PDGF（終濃度60ng／ml）的DMEM。以上各組均培養(yǎng)24小時(shí)，分別收集細(xì)胞。

五、大鼠肝組織PDGF-BB表達(dá)的檢測(cè) 采用SP法，兔抗鼠PDGF-BB多克隆抗體（工作濃度1：400）購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

六、肝組織及HSCsⅠ型膠原mRNA檢測(cè) 采用RT-PCR法。引物由華大基因研究中心合成。引物詳見表1。

表1 引物序列

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用 SPSS 13.0軟件，所有數(shù)據(jù)均用表示，采用單因素方差分析，然后用LSD法進(jìn)行兩兩比較。P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.01為有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

結(jié)果

一、中藥對(duì)大鼠血清生化指標(biāo)的影響 模型組大鼠血清ALT、AST和球蛋白含量明顯高于正常對(duì)照組，白蛋白和白/球比明顯低于正常對(duì)照組（P＜0.01）；肝復(fù)康治療組大鼠血清ALT、AST水平及血清球蛋白水平均明顯降低，與模型組相比有顯著性差異（P＜0.01）；治療組大鼠血清白蛋白和白/球比水平明顯上升，與模型組相比有顯著性差異（P＜0.01，表2）。

表2 各組血清生化指標(biāo)（）的比較

表2 各組血清生化指標(biāo)（）的比較

與模型組比，①P＜0.01

組別 只 ALT（U/L）AST（U/L）白蛋白（g/L）球蛋白（g/L） 白球比對(duì)照組 12 20.26±6.12① 42.75±10.19① 42.03±5.17① 23.45±4.61①1.91±0.24①模型組 11 74.19±11.74 89.63±11.97 26.41±3.79 34.42±2.53 0.91±0.30治療組 12 28.73±7.59① 47.01±10.72① 40.92±6.38① 24.93±4.43①1.61±0.41①

二、肝復(fù)康對(duì)大鼠肝組織PDGF-BB蛋白表達(dá)的影響 在正常組大鼠肝細(xì)胞PDGF-BB呈弱表達(dá)；模型組大鼠肝組織PDGF-BB呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，主要見于纖維間隔區(qū)，尤其見于纖維間隔和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)區(qū)，細(xì)胞內(nèi)有粗糙的陽(yáng)性團(tuán)塊表達(dá)；與模型組相比，治療組大鼠肝組織PDGF-BB陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量則明顯減少。對(duì)PDGF-BB蛋白光密度積分分析，發(fā)現(xiàn)模型組PDGF-BB的表達(dá)（0.297±0.01）顯著高于正常組（0.229±0.03，P＜0.01）；治療組 PDGF-BB 表達(dá)（0.231±0.04）較模型組明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而治療組與正常對(duì)照組比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖1）。

圖1 大鼠肝組織PDGF-BB表達(dá)情況（SP，×400）

三、肝復(fù)康對(duì)肝組織Ⅰ型膠原mRNA水平的影響 正常組大鼠肝組織Ⅰ型膠原mRNA水平較低；模型組大鼠肝組織則明顯上升，與正常組相比有顯著性差異（P＜0.01）；治療組大鼠肝組織較模型組明顯下降，有顯著性差異（P＜0.01），但與正常對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05，圖 2、3）。

圖2 肝組織Ⅰ型膠原mRNA水平

圖3 肝組織β-actin mRNA水平

四、肝復(fù)康對(duì)HSCsⅠ型膠原mRNA水平的影響 在未加入PDGF刺激的正常對(duì)照組，細(xì)胞Ⅰ型膠原mRNA呈相對(duì)低水平；在加入對(duì)照血清及PDGF刺激的模型組，細(xì)胞Ⅰ型膠原mRNA水平與正常對(duì)照組相比明顯上調(diào)（P＜0.01）；藥物治療組與模型組比，由PDGF刺激誘導(dǎo)的Ⅰ型膠原mRNA水平明顯下降（P＜0.01，圖 4）。

圖4 HSCsⅠ型膠原mRNA水平

討論

肝纖維化的發(fā)生機(jī)制是十分復(fù)雜的病理生理學(xué)過(guò)程，主要由于ECM過(guò)度增生及降解減少所致。HSC在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[5，6]。許多細(xì)胞因子可作用于HSC，經(jīng)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑使其激活[7，8]，并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞。PDGF能夠強(qiáng)烈刺激HSC[9，10]，使其活化，并分泌大量ECM，沉積于肝臟。這也是肝纖維化形成的關(guān)鍵。PDGF主要有三種形式的二聚體亞型，即PDGF-AA、PDGF-BB及PDGF-AB。二聚體之間通過(guò)三對(duì)二硫鍵相連接[11]。最近還發(fā)現(xiàn)了PDGF家族的新成員PDGF-C和PDGF-D。目前的研究表明，他們與惡性腫瘤的形成和胚胎發(fā)育有關(guān)[12]。PDGF必須與細(xì)胞膜上的相應(yīng)受體結(jié)合后才能發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。PDGF受體（PDGFR）分子由 α（PDGFR-α）及 β（PDGFR-β）兩種亞單位組成，在肝纖維化時(shí)HSC表面的PDGF受體以β受體為主，該受體與PDGF-BB具有較強(qiáng)的親和力，故PDGF-BB在肝纖維化過(guò)程中的作用尤為突出[13，14]。有研究發(fā)現(xiàn)在肝纖維化時(shí)，PDGF-BB mRNA水平明顯上調(diào)[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠肝組織PDGF-BB陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目明顯增多，這與以往所報(bào)道的PDGF-BB在肝纖維化發(fā)生中的作用相符。

中藥肝復(fù)康的主要成分有丹參（活血化瘀）、柴胡、當(dāng)歸（補(bǔ)血合血）、黃芪（益氣）、赤、白芍（活血化瘀）等。本課題組多年來(lái)已經(jīng)證實(shí)其對(duì)肝纖維化具有很好的治療作用[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組相比，治療組大鼠血清ALT、AST和球蛋白水平明顯下降，白蛋白和白/球比明顯升高；免疫組織化學(xué)染色顯示治療組肝組織PDGF-BB陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較模型組明顯減少。此外，應(yīng)用肝復(fù)康治療后，肝組織和HSC中Ⅰ型膠原mRNA水平較模型組也明顯下調(diào)。因此，本研究通過(guò)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)，肝復(fù)康通過(guò)降低PDGF的表達(dá)，抑制了Ⅰ型膠原的合成，緩解了肝纖維化的程度。

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