枯草桿菌腸球菌二聯(lián)活菌膠囊對非酒精性脂肪性肝炎患者血清內(nèi)毒素水平的影響

楊林輝 郭昭友 曹 明 向 姝 劉國棟 譚朝霞

近年來，非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）的發(fā)病率正穩(wěn)步上升。非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）是NAFLD病程進(jìn)展中的主要階段，可以進(jìn)一步發(fā)展為肝纖維化、肝硬化[1]，甚至原發(fā)性肝癌[2]。NAFLD的發(fā)病機(jī)制至今尚未明確。在眾多致病因素中，小腸細(xì)菌過度生長、細(xì)菌移位、腸黏膜通透性改變等所致的腸源性內(nèi)毒素血癥 （intestinal endotoxemia，IETM）在NASH發(fā)病中起著重要的作用[3，4]。隨著“腸-肝”軸（Gut-Liver Axis）[5]這一概念的提出，腸道微生態(tài)失衡及腸粘膜屏障的損害正成為肝病研究的熱點(diǎn)。目前，對于NASH患者腸道通透性的研究鮮見報道。本文就NASH患者腸道通透性的變化及其與IETM的關(guān)系進(jìn)行了初步研究，并采用微生態(tài)制劑枯草桿菌腸球菌二聯(lián)活菌膠囊進(jìn)行干預(yù)治療，以觀察其對NASH患者腸道通透性及血清內(nèi)毒素水平的影響。

資料與方法

一、研究對象及分組 2010年3月至2011年10月本院經(jīng)臨床、實(shí)驗(yàn)室和B超檢查診斷為NASH患者60例，男性32例，女性28例，年齡25～70歲，平均年齡47.5±l2.3歲。所有患者診斷符合NASH診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]。排除肝炎病毒感染，排除應(yīng)用抗生素、微生態(tài)調(diào)節(jié)劑、酸奶、胃腸道動力藥物及其他可影響腸道通透性制劑的患者。另選擇30例健康成年人為對照組，男女各15例，年齡20～70歲，平均年齡47.1±10.7歲。

二、給藥方法 健康人不給藥物處理；治療組給予枯草桿菌腸球菌二聯(lián)活菌膠囊（美常安，北京韓美藥品有限公司）500 mg口服，3次/日，治療4周。

三、血清學(xué)指標(biāo)檢測 采用酶學(xué)分光光度法檢測D-乳酸（D-乳酸、D-乳酸標(biāo)準(zhǔn)液和D-乳酸脫氫酶為美國Sigma公司產(chǎn)品）；采用分光光度法測定二胺氧化酶（DAO，鄰茴香胺甲醇溶液、尸胺二氫氯化物、辣根過氧化物酶和二胺氧化酶標(biāo)準(zhǔn)液為美國Sigma公司產(chǎn)品）；采用鱟試劑基質(zhì)偶氮顯色法測定血清內(nèi)毒素（試劑盒由上海伊華醫(yī)學(xué)科技公司提供）；使用酶法檢測血清ALT（日本日立公司生化分析儀）。

結(jié)果

一、兩組人群有關(guān)指標(biāo)的比較 NASH患者血清內(nèi)毒素與健康組比較顯著增高，且具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=7.71，P＜0.01）；美常安治療后與治療前比較，血清內(nèi)毒素水平顯著下降，且具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-3.72，P＜0.01，表1）。

表1 兩組血清內(nèi)毒素、DAO、D-乳酸和ALT水平（）的比較

表1 兩組血清內(nèi)毒素、DAO、D-乳酸和ALT水平（）的比較

與健康組比較，①P＜0.01，②P＜0.05；與治療前比較，③P＜0.01，④P＜0.05

組別 例數(shù) 時間 內(nèi)毒素（EU/l）DAO（U/ml）D-乳酸（mg/l）ALT（U/l）正常人 30 109.8±17.81 2.3±0.48 5.3±0.97 27.7±6.89 NASH 60 治療前 143.6±21.41① 2.6±0.47② 6.1±1.05① 84.9±23.84治療后 127.6±17.90③ 2.4±0.45④ 5.6±1.03③ 68.4±17.84③

二、兩組腸道通透性的變化 NASH患者血清二胺氧化酶及D-乳酸與健康組比較顯著增高（t=2.24，P＜0.05；t=4.89，P＜0.01）；美常安治療后與治療前比較，血清二胺氧化酶及D-乳酸水平顯著下降（t=-2.26，P＜0.05；t=-4.50，P＜0.01，表1）；由于血清二胺氧化酶及D-乳酸水平能較好地反映腸道通透性的變化[8]，故結(jié)果提示NASH患者較健康人群腸道通透性顯著增高，而當(dāng)應(yīng)用美常安治療后，NASH患者腸道通透性明顯下降。

三、兩組血清ALT水平的變化 美常安治療后與治療前比較，NASH患者血清ALT水平顯著下降（t=-4.55，P＜0.01，表1）。

討論

人類正常腸道菌群由30屬500種細(xì)菌組成,形成一個極其復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)，各菌群間按一定比例組合，互相制約、互相依存，在質(zhì)和量上形成一定的生態(tài)平衡。這些正常菌群對人體消化吸收起著重要作用。肝臟與胃腸道的解剖和功能關(guān)系密切，兩者相互依存，相互影響，被學(xué)者稱為腸-肝軸[4]。腸粘膜屏障能夠防止腸內(nèi)的有害物質(zhì)如細(xì)菌和毒素穿過腸粘膜進(jìn)入人體內(nèi)其他組織、器官和血液循環(huán)。腸粘膜通透性與腸屏障功能有關(guān)。腸腔內(nèi)滲透壓改變、疾病、藥物、飲食、細(xì)胞因子、激素等均可引起腸粘膜通透性的改變而影響腸屏障功能[7]。有證據(jù)表明NASH存在腸道菌群失調(diào)、革蘭陰性桿菌過度生長和IETM[3，4]。

由于腸粘膜通透性改變能準(zhǔn)確反映腸粘膜損害，通過檢測血D-乳酸和DAO活性，可間接反映腸道黏膜的完整性和通透性變化[8]。本研究顯示治療前NASH患者與正常對照組比較，DAO、D-乳酸和內(nèi)毒素水平顯著增高，提示NASH患者腸道通透性增高并存在IETM。由于肝腸關(guān)系密切，在正常情況下，腸粘膜是抵御外源性物質(zhì)入血的第一道屏障，肝臟則提供第二道屏障防護(hù)。當(dāng)脂肪肝患者進(jìn)展到NASH時，肝細(xì)胞發(fā)生凋亡、壞死，肝功能進(jìn)一步受損。肝功能受損后，肝細(xì)胞排泌膽汁減少[9]，改變了腸道微生態(tài)環(huán)境；肝臟處理腸道來源毒物的能力降低，而且腸道毒物可能蓄積損害腸粘膜屏障；NASH患者腸道消化功能下降，腸蠕動減慢、延遲，使腸道清除能力降低，給過路菌提供接觸、粘附黏膜的機(jī)會；腸道運(yùn)動減弱，分泌、吸收減少，對細(xì)菌的機(jī)械排空作用減弱；抗體、溶菌酶、粘液及酸堿分泌減少，使環(huán)境有利于細(xì)菌生長，腸壁局部抵抗力下降，腸腔內(nèi)pH上升，細(xì)菌生長受影響；腸道發(fā)生炎癥時，腸壁交感神經(jīng)受到抑制，腸壁血管發(fā)生充血，腸腔膨脹擴(kuò)張，造成腸黏膜局部缺血、缺氧和小腸絨毛壞死、脫落；腸粘膜攝取谷氨酰胺減弱，腸粘膜修復(fù)能力降低。這些因素均可加劇NASH患者腸道菌群失調(diào)。NASH患者腸道內(nèi)菌群失調(diào)，腸道革蘭陰性桿菌過度生長繁殖，腸道抗定植能力下降，導(dǎo)致腸道原有的生物屏障受損，結(jié)果使腸道通透性明顯增高，大量的細(xì)菌內(nèi)毒素可通過損害的腸粘膜屏障進(jìn)入門靜脈。而此時已發(fā)生脂肪變的肝細(xì)胞處理內(nèi)毒素的能力大大降低，于是內(nèi)毒素便可順利通過肝臟這第二道“防線”進(jìn)入血液循環(huán)，形成IETM。而內(nèi)毒素不僅直接損害肝細(xì)胞[9]，還可抑制新生腸上皮細(xì)胞的遷移而延遲腸上皮細(xì)胞修復(fù)因子對損傷腸黏膜的修復(fù)，繼而出現(xiàn)局部腸黏膜破損[10]。與此同時，內(nèi)毒素啟動剌激肝臟庫普弗細(xì)胞釋放各種介質(zhì)，包括細(xì)胞因子、脂類介質(zhì)、活性氧中間體、活性氮中間體、蛋白酶類等，形成瀑布反應(yīng)[11，12，13]。這些介質(zhì)本身不僅可導(dǎo)致腸道通透性的增加[14]，而且一些炎癥因子如腫瘤壞死因子與壞死性炎癥及纖維化密切相關(guān)[15]，它們還可誘導(dǎo)產(chǎn)生大量血管活性物質(zhì)NO，高濃度的NO可破壞肌動蛋白細(xì)胞骨架和松散細(xì)胞緊密連接，引起腸上皮通透性增大，結(jié)果導(dǎo)致腸粘膜缺血缺氧，腸粘膜屏障損害[4]。因此，一方面脂肪變的肝細(xì)胞已經(jīng)相當(dāng)脆弱，經(jīng)受不住“二次打擊”[16]，另一方面IETM誘導(dǎo)產(chǎn)生的大量炎性細(xì)胞因子進(jìn)一步破壞腸粘膜屏障，致腸道通透性增加，加重已形成的IETM，結(jié)果形成惡性循環(huán)，加劇脂肪性肝炎。

本實(shí)驗(yàn)采用的微生態(tài)制劑含有屎腸球菌和枯草桿菌兩種活菌。屎腸球菌對致病菌抑制作用強(qiáng)、繁殖迅速。枯草桿菌屬過路菌，其作用機(jī)制是利用生物奪氧作用，其在腸道定植降低了局部氧濃度和氧化還原電位，造成適合厭氧菌群的生長環(huán)境，促進(jìn)雙歧桿菌等的生長[17]?？莶輻U菌還能產(chǎn)生多種消化酶，促進(jìn)消化吸收，并能產(chǎn)生多種抗菌化合物，抑制變形桿菌屬、大腸埃希菌、葡萄球菌屬等有害菌，從而抑制革蘭陰性桿菌及致病菌的生長[18]。與傳統(tǒng)微生態(tài)制劑相比，通過將耐膽鹽的屎腸球菌與耐酸的枯草桿菌結(jié)合而制成的腸溶制劑，能在消化道中存活，活菌數(shù)量大，且能與抗生素合用，從而最大限度地發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)，確保了治療的有效性。研究表明美常安還具有抗脂質(zhì)過氧化反應(yīng)等作用[19]。因此，對NASH有治療作用。本研究顯示美常安干預(yù)前后，患者DAO、D-乳酸、內(nèi)毒素及ALT水平顯著降低，而對照組并無顯著改變，提示美常安能促進(jìn)腸道菌群的修復(fù)及平衡，在一定程度上解決了腸道菌群失調(diào)及腸道革蘭陰性桿菌過度生長的問題，改善了微生態(tài)失衡，修復(fù)了受損的腸粘膜屏障，使腸粘膜通透性顯著降低，IETM也隨之降低，進(jìn)一步抑制了肝臟庫普弗細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子對肝臟的“二次打擊”，因而NASH患者的炎癥得到改善，ALT降低。我們在試驗(yàn)中還觀察到雖然ALT有一定程度的降低，但ALT仍遠(yuǎn)大于正常值，這可能由于NASH的發(fā)病是多因素共同作用的結(jié)果，只進(jìn)行單一的腸道干預(yù)治療可能療效并不理想。

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