分蘗洋蔥ISSR-PCR擴(kuò)增體系的建立

劉淑芹，吳鳳芝，劉守偉，潘 凱

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，哈爾濱 150030）

分蘗洋蔥（Allium cepa L.var.multiplcans Bailey syn.var.Agrogatum Don）為蔥科（Alliaceae）蔥屬（Allium）草本植物，又稱毛蔥、珠蔥，一年生草本蔥蒜類蔬菜，是洋蔥種質(zhì)資源重要組成部分[1]。鱗莖中含有特殊辛辣味的揮發(fā)性硫化物，具有殺毒消菌作用[2]，種植面積逐年增加。但是現(xiàn)有栽培的分蘗洋蔥多為表現(xiàn)良好的品系或農(nóng)家品種，應(yīng)用于生產(chǎn)推廣的品種很少，加之分蘗洋蔥為營養(yǎng)體繁殖，每年種用毛蔥的存貯問題，費(fèi)工費(fèi)力，效果不佳，在生產(chǎn)上也限制其大面積推廣[3]。因此，加速分蘗洋蔥的品種篩選與鑒定，促進(jìn)新品種的繁育以及雜交親本合理選擇選配，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)分蘗洋蔥種子繁殖是解決問題的關(guān)鍵。而了解分蘗洋蔥的遺傳背景和DNA指紋圖譜構(gòu)成，確定不同品種的遺傳多樣性，明確分蘗洋蔥資源的親緣關(guān)系和分類地位，是實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的必要前提。

ISSR（Inter simple sequence repeat）是利用一條包含簡單重復(fù)序列，并在3'或5'端錨定的寡聚核苷酸引物，對SSR（微衛(wèi)星）之間一段短DNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增的一種新型分子標(biāo)記技術(shù)[4-7]。由Zietkiewicz等提出并逐漸應(yīng)用開來，為顯性標(biāo)記，符合孟德爾式遺傳規(guī)律。相對SSR等其他分子標(biāo)記方法，操作技術(shù)比較簡單，獲得結(jié)果快、成本低[7]，加之其具有分布廣泛且變異快的特點(diǎn)，ISSR標(biāo)記較其他分子標(biāo)記方法可獲得更多基因位點(diǎn)的差異。這些特點(diǎn)使其產(chǎn)生后迅速發(fā)展，近年來在多種作物中都有應(yīng)用，例如水稻、茄子、小麥、柑橘、松樹等[8-12]，為作物的DNA指紋圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性分析、特殊基因定位、核心種質(zhì)保存利用等提供強(qiáng)有力的分子生物學(xué)理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。

ISSR技術(shù)在分蘗洋蔥上的應(yīng)用尚未見報(bào)道。本研究以分蘗洋蔥葉片DNA為研究對象，對ISSR-PCR擴(kuò)增體系中退火溫度、Mg2+濃度、dNTP濃度、Taq酶含量以及引物濃度等各因素進(jìn)行篩選和優(yōu)化，以期明確適用于分蘗洋蔥ISSR分析的最佳反應(yīng)體系，為ISSR分子標(biāo)記技術(shù)在分蘗洋蔥遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建、核心種質(zhì)保存利用等方面的應(yīng)用提供技術(shù)支撐和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

分蘗洋蔥品種來自依安、五常、綏化，2010年10月16日在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝實(shí)驗(yàn)站日光溫室進(jìn)行盆栽試驗(yàn)。選擇成熟度好、大小均勻一致，無病蟲害的分蘗洋蔥鱗莖，用10 cm×10 cm的營養(yǎng)缽栽植，每缽栽1株，每品種10株，3次重復(fù)，置于全光溫室中培養(yǎng)，晝溫28℃，夜溫15°C，常規(guī)栽培管理。于幼苗期（出苗后10～15 d）取分蘗洋蔥幼嫩筒狀葉片，液氮速凍后于超低溫-80℃保存。

ISSR引物由上海生工合成，序列來自加拿大哥倫比亞大學(xué)，分別為840：GAGAGAGAGAGAGA GAYT； 809： AGAGAGAGAGAGAGAGG。 Marker采用DL2000，Mg2+、Taq酶等試劑，均為MBI公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取

采用植物基因組DNA試劑盒（北京TIANGEN試劑公司）提取植物DNA。分別在260和280 nm處檢測所提取基因組DNA的OD值，根據(jù)OD260/OD280值判斷其純度，然后再用1.2%瓊脂糖凝膠對其進(jìn)行電泳，在紫外檢測儀上觀察其純度并判斷DNA分子的大小及濃度一致性[13]。

1.2.2 ISSR-PCR反應(yīng)參數(shù)的優(yōu)化

以ISSR引物840的Tm值為基礎(chǔ)，設(shè)置4個(gè)退火溫度（54、56、58、60℃），采用分蘗洋蔥葉片DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并依據(jù)PCR擴(kuò)增譜帶有無和清晰度確定最適引物退火溫度。

采用篩選出來的適宜退火溫度，對影響ISSR-PCR反應(yīng)各因素進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)而確定適宜PCR擴(kuò)增條件。引物為ISSR 809和840，反應(yīng)總體積為25 μL。其中，DNA模板量設(shè)置6個(gè)水平：10、20、30、40、50、60 ng；5 mmol·L-1引物濃度設(shè)置3個(gè)添加量水平:1、2、3 μL；2.5 mmol·L-1dNTP 添加量設(shè)置 5個(gè)水平:1、2、3、4、5 μL；25 mmol·L-1MgCl2添加量設(shè)置5個(gè)水平：1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 μL；5 U·μL-1Taq酶用量也設(shè)置5個(gè)水平：0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 μL。

1.2.3 ISSR-PCR產(chǎn)物擴(kuò)增條件及檢測方法

PCR產(chǎn)物擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min，隨后45個(gè)循環(huán)，每循環(huán)94℃變性30 s，57.5℃退火30 s，72℃延伸90 s，最后1個(gè)循環(huán)后72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠（含有機(jī)染料Goldenview 0.5 μg·mL-1）中以5 V·cm-1的電壓電泳分離，經(jīng)全自動凝膠成像系統(tǒng)Syngene Gene Genius觀察、照像。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物退火溫度對ISSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)的影響

試驗(yàn)設(shè)置4個(gè)退火溫度（54、56、58、60℃），進(jìn)行PCR擴(kuò)增（見圖1）。結(jié)果表明，隨著引物840退火溫度升高，擴(kuò)增譜帶亮度明顯提高，其中在54℃時(shí)，發(fā)生部分條帶的缺失；而58和60℃時(shí)則出現(xiàn)擴(kuò)增結(jié)果彌散、背景增強(qiáng)的現(xiàn)象。為保證ISSR擴(kuò)增結(jié)果的穩(wěn)定性和特異性，確定引物最適退火溫度為56℃。

2.2 不同PCR參數(shù)對ISSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)的影響

2.2.1 引物劑量

采用引物809、840對三個(gè)分蘗洋蔥品種進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選引物（5 mmol·L-1）在體系中最佳劑量。結(jié)果表明，在25 μL反應(yīng)條件下，2～3 μL引物添加量，均可擴(kuò)增出全部產(chǎn)物，但引物劑量小于2 μL時(shí)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量很少，譜帶帶型較弱，而3 μL時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物PCR譜圖清晰，擴(kuò)增完全，多態(tài)性好，效果最佳，因此引物在反應(yīng)體系中最適添加量確定為3 μL（見圖2）。

圖1 引物退火溫度對ISSR-PCR的影響Fig.1 Effect of primer annealing temperature on ISSR-PCR

圖2 引物濃度對ISSR-PCR的影響Fig.2 Effect of primer concentration on ISSR-PCR

2.2.2 模板劑量

采用引物840對三個(gè)分蘗洋蔥品種進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選DNA模板量在體系中最佳用量。結(jié)果如圖3所示，10～60 ng的DNA模板用量均有PCR擴(kuò)增結(jié)果，但低于20 ng的DNA模板所擴(kuò)增出來的產(chǎn)物逐漸變少，而高于40 ng的DNA模板未對PCR擴(kuò)增結(jié)果產(chǎn)生本質(zhì)影響，所以在保證試驗(yàn)結(jié)果的前提下，考慮到經(jīng)濟(jì)原則，盡量縮減DNA用量，最終確定最適DNA模板量為40 ng。

2.2.3 dNTP劑量

采用引物809、840對三個(gè)分蘗洋蔥品種進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選dNTP（2.5 mmol·L-1）在體系中最佳用量。高濃度的dNTP易產(chǎn)生錯(cuò)誤擴(kuò)增片段摻入，濃度過高還將出現(xiàn)不擴(kuò)增現(xiàn)象；但過低的dNTP量，則出現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物量降低的現(xiàn)象。由圖4可看出，1～5 μL的添加量中，3 μL的dNTP即可擴(kuò)增出全部產(chǎn)物，且條帶清晰，無拖尾等問題。最終確定最適dNTP量為3 μL。

2.2.4 Mg2+濃度的確定

Mg2+濃度是影響PCR擴(kuò)增的重要因素，它的含量多少直接影響PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量[11]。通常情況下，Mg2+濃度的增加可提高PCR產(chǎn)物量，且伴有非特異性擴(kuò)增的產(chǎn)生，最終降低結(jié)果的真實(shí)性。

圖3 DNA模板量對ISSR-PCR的影響Fig.3 Effect of DNA concentration on ISSR-PCR

圖4 dNTP濃度對ISSR-PCR的影響Fig.4 Effect of dNTP concentration on ISSR-PCR

圖5為Mg2+濃度在體系中不同添加量的篩選結(jié)果，1.5 μL的Mg2+濃度，PCR擴(kuò)增不完全，譜帶少，產(chǎn)量低；隨Mg2+添加量的不斷增加，擴(kuò)增樣品的背景也不斷加深，引物840在3.0 μL的Mg2+濃度時(shí)出現(xiàn)了明顯的帶型彌散現(xiàn)象。為保證結(jié)果確定2.0 μL的Mg2+為最適用量。

2.2.5 Taq酶用量的確定

Taq酶用量是影響PCR反應(yīng)的另一個(gè)重要因素，其對擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)量有直接影響[11]。本試驗(yàn)中Taq酶用量設(shè)置為0.2～0.6 μL。擴(kuò)增結(jié)果見圖6，從0.2～0.6 μL各用量Taq酶均可擴(kuò)增出譜帶，且隨著酶用量的增多，擴(kuò)增產(chǎn)物清晰度和產(chǎn)量均有所升高。但高濃度（0.5、0.6 μL）Taq酶用量反而擴(kuò)增出較弱的帶型。本著確保最佳效果和最低成本原則，確定Taq酶最佳用量為0.4 μL。

2.3 ISSR-PCR優(yōu)化體系的應(yīng)用

將篩選后的各條件進(jìn)行組合，采用引物809和840對三個(gè)分蘗洋蔥品種進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測優(yōu)化體系的適用性。結(jié)果見圖7，兩個(gè)ISSR引物對三個(gè)分蘗洋蔥品種擴(kuò)增出的條帶清晰、重復(fù)性好，而且只采用ISSR 809即可將三個(gè)分蘗洋蔥品種加以區(qū)別，表明優(yōu)化后的PCR反應(yīng)體系穩(wěn)定可靠，可在分蘗洋蔥品種的遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建等研究中應(yīng)用。

圖5 Mg2+濃度對ISSR-PCR的影響Fig.5 Effect of Mg2+concentration on ISSR-PCR

圖6 Taq酶用量對ISSR-PCR的影響Fig.6 Effect of Taq DNA polymerase on ISSR-PCR

圖7 引物809和840的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.7 ISSR-PCR results of prime 809 and 840

3 討論與結(jié)論

合適的體系反應(yīng)參數(shù)是進(jìn)行良好ISSR-PCR擴(kuò)增的首要前提[11]。其中，DNA模板量是影響反應(yīng)條件的重要因素之一，具有純度高、質(zhì)量好的DNA模板才能有效進(jìn)行PCR擴(kuò)增。一般認(rèn)為具有1.6～1.9吸光值（A260/A280）DNA才能符合基本擴(kuò)增需要，需注意的是DNA提取后存放時(shí)間過久，DNA的降解會導(dǎo)致擴(kuò)增失?。籑g2+濃度是第二個(gè)重要因素，它對Taq酶活性具有絕對性的影響，從而制約著PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量，其濃度對Taq酶具有雙重作用，低濃度時(shí)，不能對酶起到活化作用，高濃度反而會使酶活性產(chǎn)生抑制作用；引物濃度為第三個(gè)因素，總體原則是適量使用，因其在體系中量過少，會引起PCR擴(kuò)增產(chǎn)物少，并出現(xiàn)擴(kuò)增譜帶弱，亮度不達(dá)標(biāo)現(xiàn)象，而量過多時(shí)將會產(chǎn)生非特異性譜帶；第四個(gè)重要因素是dNTP的濃度，作用效果類似于引物濃度，dNTP的濃度過低，擴(kuò)增產(chǎn)物偏少，條帶亮度不夠，擴(kuò)增不完全，濃度過高時(shí)，產(chǎn)生錯(cuò)誤擴(kuò)增條帶的滲入，干擾正常的PCR結(jié)果。為此，要本著確保擴(kuò)增完全，譜帶清晰，多態(tài)性良好，且具有較好重復(fù)性，兼顧低成本的原則，構(gòu)建合適的ISSR-PCR反應(yīng)體系。

本試驗(yàn)對影響ISSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)的Mg2+濃度、dNTP濃度、Taq酶含量、引物濃度、模板DNA量和退火溫度的最佳條件進(jìn)行篩選和優(yōu)化，初步建立適合分蘗洋蔥植物ISSR反應(yīng)體系，即DNA模板量40 ng（2 μL）， 10 × PCR Buffer 3 μL， Mg2+（2.5 mmol·L-1）2.0 μL，dNTPs（2.5 mmol·L-1） 3 μL，引物（5 mmol·L-1）3 μL，Taq 酶（5 U·μL-1）0.4 μL，最適退火溫度為56℃。擴(kuò)增反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min，隨后45個(gè)循環(huán)，每循環(huán)94℃變性30 s，57.5℃退火30 s，72℃延伸90 s，最后1個(gè)循環(huán)后72℃延伸10 min。

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