煙草野火病菌拮抗細(xì)菌的篩選及其應(yīng)用研究

文景芝，楊曉敏，李櫻梅，孫劍萍

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.牡丹江煙草科學(xué)研究所，黑龍江 牡丹江 157011）

由丁香假單胞桿菌煙草致病變種[Pseudomonas syringae pv.tabaci（World et Foster）Young et al.]引起的煙草野火病屬暴發(fā)性、毀滅性細(xì)菌病害[1]，其發(fā)生嚴(yán)重影響煙草的品質(zhì)和產(chǎn)量。該病最早于1917年由美國人Wolf和Foster報道，1917～1918年野火病成為美國北卡州危害最嚴(yán)重的病害[2]。近年來，該病在我國云南、貴州、河南、山東、湖北、遼寧和吉林等省煙草種植區(qū)均大面積發(fā)生，并有逐年加重的趨勢。目前該病害在抗病育種方面雖然取得一些進(jìn)展，但研究表明中國推廣的烤煙品種長脖黃、NC82、G140、G28、K326、紅花大金元等均不抗野火病[3]。目前生產(chǎn)上最常用的藥劑為農(nóng)用鏈霉素，雖對該病害防效較好，但連續(xù)使用不僅造成環(huán)境污染和殘留問題，對煙葉出口和卷煙安全帶來不利影響，而且使病原菌產(chǎn)生抗藥性，因此生物防治越來越受到人們的關(guān)注。當(dāng)前應(yīng)用較多的生防細(xì)菌主要有芽孢桿菌（Bacillus spp.）、假單胞桿菌（Pseudomonas spp.）、土壤放射桿菌（Agrobacterium radiobacter）以及其他一些細(xì)菌[4]。目前已篩選出對野火病菌有抑制作用的株系和對病菌有很高活性的放線菌類型C-25，A/60c-7/2和C-7/20，而且在美國放射形野桿菌（Radial field bacillus）菌系K84已進(jìn)入商品化應(yīng)用[5]。丁愛云等篩選出對野火病拮抗活性較強(qiáng)的菌株，其中細(xì)菌2株，放線菌2株，但國內(nèi)在野火病的生物防治方面仍停留在室內(nèi)試驗階段，研究還不夠深入[6]?？紤]到從煙葉中分離到細(xì)菌更容易定殖于煙葉中，因此本研究從不同品種的健康煙葉中分離大量細(xì)菌，從中篩選對野火病菌表現(xiàn)較強(qiáng)拮抗能力且抑菌效果穩(wěn)定的菌株，對其進(jìn)行16S rDNA鑒定，并進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化，測定發(fā)酵液的田間防效。為測定拮抗細(xì)菌在煙草葉片中的定殖能力，本研究對拮抗細(xì)菌進(jìn)行利福平抗性誘導(dǎo)試驗，為生物農(nóng)藥的開發(fā)和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株及培養(yǎng)基

煙草野火病菌（Pseudomonas syringae pv.tabaci）由牡丹江煙草科學(xué)研究所提供。

細(xì)菌的分離培養(yǎng)采用NA培養(yǎng)基；細(xì)菌的發(fā)酵培養(yǎng)采用NB培養(yǎng)液；細(xì)菌的保存采用PDA培養(yǎng)基。培養(yǎng)基配方參照文獻(xiàn)[7]。

1.2 煙草葉片的采集與細(xì)菌的分離

從牡丹江煙草科學(xué)研究所試驗田采集不同品種健康煙葉30份，分別取2 g葉片研磨，采用平板稀釋分離法分離葉片內(nèi)外的細(xì)菌[8]。挑取不同類型單菌落在NA平板上劃線純化培養(yǎng)，將單菌落轉(zhuǎn)接到PDA斜面上編號培養(yǎng)后，保存待用。

1.3 煙草野火病菌拮抗細(xì)菌的篩選

拮抗細(xì)菌的篩選：將混有5%病原菌發(fā)酵液的培養(yǎng)基冷卻成平板。吸取70 μL待測細(xì)菌菌懸液在平板上劃線[9]，以無菌培養(yǎng)液劃線為對照，28℃培養(yǎng)2～3 d后觀察抑菌效果，測量抑菌帶寬度。對于有抑菌效果的進(jìn)行皿內(nèi)復(fù)篩，檢測其遺傳穩(wěn)定性，方法同上。

拮抗細(xì)菌的純培養(yǎng)[10]：把稀釋10-5倍的菌液涂布于牛肉膏固體培養(yǎng)基平板，培養(yǎng)一段時間后形成單菌落。挑選長勢好、菌落飽滿的菌株用連續(xù)劃線法對細(xì)菌純化培養(yǎng)，保存待用。

1.4 拮抗細(xì)菌菌株的鑒定

拮抗菌株的形態(tài)觀察及生理生化特性鑒定，參照文獻(xiàn)[11]。

拮抗菌株的16S rDNA鑒定：采用Schroth等的方法提取拮抗細(xì)菌菌株總DNA[12]，并稍作改進(jìn)。采用細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)通用引物對F338GC和R518（引物由上海生工合成）進(jìn)行PCR。PCR反應(yīng)體系：dNTP（10 mmol·L-1）0.5 μL，10×buffer（含 MgCl2）5 μL，引物 F338GC 和 R518（25 μmol·L-1）各 1 μL，TaqDNA 酶 1 μL，模板 2 μL（200 ng·μL-1），無菌去離子水39.5 μL。PCR擴(kuò)增條件：95℃ 5 min，94℃ 10 s，62℃ 20 s，66℃40 s，68℃ 7 min，35個循環(huán)。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將PCR產(chǎn)物交上海生工測序，將測得的16S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫序列進(jìn)行BLAST分析比對，確定拮抗細(xì)菌菌株的分類地位。

1.5 拮抗細(xì)菌菌株的利福平抗性標(biāo)記

參照杜立新等的方法并稍加改進(jìn)[13]。首先在NA平板上活化拮抗細(xì)菌菌株，挑取單菌落在含有利福平5 μg·mL-1的NB培養(yǎng)基中28℃下震蕩培養(yǎng)2 d，然后在含有5 μg·mL-1利福平的NA平板上培養(yǎng)，待長出菌落后，逐級提高利福平濃度進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，使菌株逐漸適應(yīng)高濃度利福平。用NA平板拮抗試驗驗證抗藥菌株對煙草野火病菌的拮抗性，以原始菌株為對照。

1.6 拮抗細(xì)菌發(fā)酵條件的優(yōu)化

1.6.1 發(fā)酵液中拮抗細(xì)菌活菌數(shù)與菌液吸光度的相關(guān)性測定

將拮抗細(xì)菌菌懸液用無菌水稀釋成10-4、10-5、10-6、10-7四個濃度，采用UV-8000紫外分光光度計測定各濃度菌懸液OD625值，同時在NA平板上加入各濃度菌懸液100 μL，用涂布器涂勻，28℃下培養(yǎng)2 d，計測各濃度菌懸液的菌落數(shù)，計算單位體積活菌數(shù)和吸光值與活菌數(shù)的相關(guān)性。

1.6.2 單因子試驗

在發(fā)酵條件初篩的基礎(chǔ)上，選取不同單一碳源（可溶性淀粉、葡萄糖、木糖、麥芽糖、甘油、乳糖、蔗糖和甘露醇，用量0.5%）；在碳源不變情況下，選取不同單一有機(jī)氮源（牛肉膏、蛋白胨、酵母膏和胰蛋白胨，用量1%）和不同單一無機(jī)氮源（NH4NO3、（NH4）2SO4、NH4Cl和KNO3，用量1%），并進(jìn)行兩種較優(yōu)有機(jī)氮源的組合配比試驗；在較優(yōu)碳源、氮源情況下，加入不同量的NaCl（0.1%、0.3%和0.5%）；較優(yōu)碳源、氮源和NaCl中，加入不同量的無機(jī)氮源（0.1%、0.3%和0.5%）。測定各條件下菌懸液OD625值及其對煙草野火病菌的抑菌活性。

1.6.3 培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗

依據(jù)單因子試驗結(jié)果，選取較優(yōu)不同碳源濃度（0.1%、0.3%和0.5%）、較優(yōu)不同有機(jī)氮源濃度（0.5%、1%和2.0%）、較優(yōu)無機(jī)不同氮源濃度（0.1%、0.3%和0.5%）、不同NaCl濃度（0.1%、0.3%和0.5%），進(jìn)行4因素3水平的正交試驗，28℃下震蕩培養(yǎng)2～3 d。測定各條件下菌懸液OD625值及其對煙草野火病菌的抑菌活性。

1.6.4 培養(yǎng)條件的優(yōu)化試驗

采用優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基，在不同培養(yǎng)溫度（25、28、33、36和39℃）、不同培養(yǎng)基pH（4.0、4.5、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和9.0）、不同接種量（1%、2%、3%、4%、5%、8%和10%）和不同通氣量（250 mL三角瓶中分別裝20、30、40、50、60、70和80 mL）條件下培養(yǎng)拮抗細(xì)菌菌株，28℃培養(yǎng)2～3 d后，測定各條件下菌懸液OD625值及其對煙草野火病菌的抑菌活性。

1.7 拮抗細(xì)菌發(fā)酵液的田間藥效試驗

本試驗于2010年6～7月在牡丹江煙草科學(xué)研究所試驗場煙田進(jìn)行，每小區(qū)有團(tuán)棵期煙株15株。共設(shè)3個處理：A-拮抗菌活菌發(fā)酵液（6倍稀釋液，約6×108cfu·mL-1）；B-拮抗菌優(yōu)化發(fā)酵液（6倍稀釋液，約6×108cfu·mL-1）；C-藥劑甜葉桔（3 000倍稀釋液）；D-清水對照。采用隨機(jī)區(qū)組排列，重復(fù)3次。采用高壓噴霧法噴霧（每處理噴施2 L），隔天重新噴1次。2 d后各處理噴施病原菌，每處理噴施2 L。噴施病原菌后保濕，第5天、第10天按照中華人民共和國煙草病害分級標(biāo)準(zhǔn)（YC T 39-1996）[3]分別調(diào)查，每小區(qū)調(diào)查10株，每株調(diào)查中下部葉片10片，計算病情指數(shù)及防治效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草野火病菌拮抗細(xì)菌的篩選

從健康煙草成熟葉片中分離到細(xì)菌287株，其中14株對煙草野火病菌具有一定拮抗作用，抑菌帶寬度在3.6～9.3 mm之間。其中菌株Y32的抑菌效果最好，并且抑菌效果穩(wěn)定（見圖1-A），至少達(dá)10代左右。

2.2 菌株Y32的鑒定

菌株Y32的形態(tài)特征觀察結(jié)果表明，菌株Y32在NA培養(yǎng)基上生長良好，菌落形態(tài)為圓形或近圓形，突起，乳白色，不透明，不產(chǎn)生色素。其生理生化特性為：運動性試驗、葡萄糖氧化發(fā)酵、M.R.試驗、V.P.試驗、檸檬酸鹽利用試驗、接觸酶試驗、淀粉水解試驗、硫化氫試驗、硝酸鹽還原試驗以及明膠液化試驗均為陽性，且NaCl含量為2%、5%、7%、10%時菌株生長良好，吲哚試驗為陰性。上述特性與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）完全一致，初步確定該菌株為枯草芽孢桿菌。

菌株Y32 16S rDNA測序結(jié)果如下：GCTATGC AATACTTACCTGCAATAGTGACGAAAGTCTGGAC GGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGG ATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTA CCGTTCGAATAGGGCGGTGCCTTGACGGTACCTAA CCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCC GCGGTAATAAAAA。此序列與GenBank中已報道的序列同源性比較結(jié)果表明，Y32與枯草芽孢桿菌 MSB10（Bacillus subtilis MSB10）的同源性達(dá)到96%，證明該菌屬于枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

2.3 拮抗細(xì)菌Y32的利福平抗性標(biāo)記

試驗最終培養(yǎng)出抗80 μg·mL-1利福平的標(biāo)記菌株，記為Y32標(biāo)記。該標(biāo)記菌株對煙草野火病菌的拮抗作用如圖1-D所示，表明Y32標(biāo)記菌株對煙草野火病菌的拮抗效果顯著低于原始菌株，而且在培養(yǎng)過程中出現(xiàn)拮抗細(xì)菌生活力下降、拮抗活性降低、菌體變透明等現(xiàn)象，與原始菌株不同，而且無法計數(shù)，因此不能作為進(jìn)一步研究拮抗細(xì)菌在煙草植株體內(nèi)定殖試驗的材料。

2.4 拮抗細(xì)菌發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.4.1 發(fā)酵液中拮抗細(xì)菌的活菌數(shù)與菌液吸光度的相關(guān)性

發(fā)酵液中拮抗細(xì)菌的活菌數(shù)量與其OD625值呈線性關(guān)系，線性方程為y=1.4541x+6.4316，r2=0.9393，因此可以用發(fā)酵液的OD625值代表發(fā)酵液中的拮抗細(xì)菌活菌數(shù)。以下試驗均用發(fā)酵液的OD625值來表示發(fā)酵液中的拮抗細(xì)菌活菌數(shù)。

2.4.2 單因子試驗

試驗結(jié)果表明，最佳碳源為葡萄糖，最適濃度為0.1%；單一氮源以蛋白胨和酵母膏為宜，其中0.5%酵母膏+0.3%蛋白胨的配比抑菌效果最好，且組合濃度為1%時拮抗細(xì)菌的產(chǎn)量最大，且抑菌帶最寬；無機(jī)氮源以0.5%KNO3最好；一定量的NaCl能促進(jìn)拮抗細(xì)菌的生長，并能提高拮抗細(xì)菌的抑菌活性，其中以0.3%NaCl效果最好。

2.4.3 培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗

以抑菌帶寬為指標(biāo)，得出拮抗細(xì)菌的實驗室最佳發(fā)酵配方為：氮源（酵母膏∶蛋白胨=5∶3）1%，葡萄糖0.1%，NaCl 0.3%，KNO30.5%。通過培養(yǎng)條件優(yōu)化試驗，結(jié)果得到抑菌帶寬度達(dá)到16.8 mm（見圖1-B），大于正交試驗結(jié)果中的最高值11.4mm。

圖1 菌株Y32對煙草野火病菌的拮抗效果Fig.1 Effect of Y32 against Pseudomonas syringae pv.tabaci

2.4.4 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

試驗結(jié)果顯示，使拮抗細(xì)菌的生長量最大、且抑菌帶最寬的培養(yǎng)條件為：溫度28℃、pH 7.0～7.5、接種量4%、裝液量250 mL三角瓶裝50 mL。

2.5 Y32發(fā)酵液對煙草野火病的田間藥效

試驗結(jié)果見表1。Y32菌株優(yōu)化發(fā)酵前防效為60.7%，顯著好于藥劑甜葉桔的防效45.3%，優(yōu)化發(fā)酵后的防效為71.6%，比優(yōu)化發(fā)酵前提高了10.9%，顯著高于其他處理。

表1 Y32發(fā)酵液對煙草野火病的田間藥效Table1 Field effect of Y32 fermentation liquid against tobacco wildfire disease

3 討論與結(jié)論

拮抗菌篩選方法中，最常用的有平板劃線法、抑菌圈法和瓊脂塊法[8]。由于本試驗中病原菌和所篩選的拮抗菌均為細(xì)菌，在以上方法的基礎(chǔ)上，將病原菌與待測細(xì)菌均制成菌懸液再進(jìn)行拮抗性鑒定，這種方法觀察結(jié)果更加直觀、快速。由于細(xì)菌在離體條件下拮抗作用與自然環(huán)境下防病作用往往不存在必然聯(lián)系，因此本試驗又將篩選出的拮抗效果較好的Y32菌株進(jìn)行田間試驗，防效較多。

細(xì)菌是目前人們研究的一類重要生防菌，能夠產(chǎn)生細(xì)菌素、抗生素及次生代謝產(chǎn)物等活性物質(zhì)，對病原菌具有很強(qiáng)的抑制作用，具有廣泛的用途和巨大的經(jīng)濟(jì)價值。已開發(fā)出大量優(yōu)良生防菌株進(jìn)行商品化應(yīng)用，取得了可觀的生態(tài)效益[14]。本試驗篩選出的枯草芽孢桿菌Y32對煙草野火病菌具有很強(qiáng)的拮抗作用。通過發(fā)酵條件優(yōu)化和培養(yǎng)基成分正交試驗，明確其最佳的發(fā)酵配方為：氮源1%（酵母膏∶蛋白胨=5∶3），葡萄糖0.1%，NaCl 0.3%，KNO30.5%；最佳培養(yǎng)條件為：發(fā)酵溫度28℃，培養(yǎng)基pH 7.0～7.5，接種量4%，裝液量250 mL三角瓶裝液50 mL。其最佳發(fā)酵條件的確定，為以后活性物質(zhì)的進(jìn)一步研究和生物農(nóng)藥的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

拮抗細(xì)菌能否在目標(biāo)植株內(nèi)定殖是生防菌取得防效的關(guān)鍵[14]，研究拮抗細(xì)菌在植株體內(nèi)定殖的方法主要有抗利福平、氨芐青霉素和卡那霉素等抗菌素標(biāo)記法及電鏡觀察法、抗血清法和免疫膠體金染色法等[15]。本試驗雖然獲得了利福平抗性標(biāo)記菌株，但由于該標(biāo)記菌株對煙草野火病菌的抑制作用顯著低于野生菌株，并且在培養(yǎng)基上菌落呈透明狀，已經(jīng)不能代表原來的野生菌株，因此認(rèn)為利福平抗性標(biāo)記不適于研究拮抗細(xì)菌在煙草葉片中的定殖能力，其他標(biāo)記方法有待研究，如綠色熒光蛋白標(biāo)記方法，本研究將針對此方法進(jìn)一步進(jìn)行該生防菌的定殖研究。

[1]袁美麗,高潔,張佳環(huán),等.煙草野火病藥劑防治研究[J].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,1994,16(4):18-23.

[2]Lucas G B.Diseases of tobacco[M].Third edition.Raleigh North Carolina,U.S.A.,1975∶397-405.

[3]孔凡玉,朱賢朝,石金開,等.我國煙草侵染性病害發(fā)生趨勢原因及防治對策[J].中國煙草,1995(1):31-34.

[4]Keer A.Interactions of soil micro flora with cucurbit wilt special emphasis on non-pathogenic Fusarium[J].Soil Biology and Biochemistry,1982,20:167-192.

[5]張廣民,呂軍鴻,闞光鋒,等.煙草野火病研究概況[J].中國煙草學(xué)報,2002,8(2):34-37.

[6]丁愛云,鄭繼法,時呈奎,等.煙草幾種重要病害拮抗菌的篩選[J].中國煙草科學(xué),1999(1):10-11.

[7]方中達(dá).植病研究方法[M].第三版.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,1998:171-208,212-218.

[8]Edwards K,John stone C,Thompson C.A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis[M].Nucleic Acids Research,1991,19:1349.

[9]王曉翠,李杰.豬源乳酸芽孢桿菌的篩選與鑒定[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2011,42(3):131-135.

[10]耿印印,王旭梅,王紅旗,等.污染土壤中耐鎘菌株的篩選、鑒定及吸附試驗研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2010,41(11):59-65.

[11]布坎南R E,吉本斯N E.伯杰細(xì)菌鑒定手冊[M].8版.北京:科學(xué)出版社,1984:54-68.

[12]Schroth N,Milton J G.Hancock.Importance of chitin synthesis for gunfal growth and as a target for antofungal agents[J].Journal of General Microbiology,1981,53(10):281-285.

[13]杜立新,馮書亮,曹克強(qiáng),等.枯草芽孢桿菌BS-208和BS-209菌株在番茄葉面及土壤中定殖能力的研究[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2004,27(6):78-82.

[14]Jiang X L,Xie D L,Ni C F,et al.The antibioticaction of zhongshenmycin[J].Acta Phytopathologica Sinica,1997,27(2):133-138.

[15]楊海蓮,孫曉璐,宋末.水稻內(nèi)生陰溝腸桿菌的定殖研究[J].自然科學(xué)進(jìn)展,1999,9(12):1241-1244.