加工番茄離區(qū)發(fā)育過(guò)程及有無(wú)離區(qū)相關(guān)生理特性分析

王傲雪，潘素麗，劉生財(cái)，李鳳蘭，王 旭，欒 杰

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，哈爾濱 150030；2.福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物工程研究所，福州 350002）

器官或組織的脫落是植物界普遍發(fā)生的生理現(xiàn)象，是細(xì)胞結(jié)構(gòu)、生理生化代謝和基因表達(dá)等過(guò)程共同作用的結(jié)果[1]。一般情況下,把器官或組織脫落的組織區(qū)域及其鄰近部分稱(chēng)為“離區(qū)”（Abscission zone，AZ），而把此區(qū)域內(nèi)僅發(fā)生組織與細(xì)胞分離的數(shù)層細(xì)胞叫“離層”（Abscission layer）[2]。早在 20世紀(jì)50年代，人們廣泛應(yīng)用菜豆進(jìn)行離區(qū)解剖學(xué)研究，確定脫落一般發(fā)生在一個(gè)可預(yù)知的、由特殊形態(tài)細(xì)胞組成的離區(qū)部位[3]。有些植物的脫落部分在接受誘導(dǎo)前無(wú)法辨認(rèn)離層細(xì)胞與其他細(xì)胞的差異[4]，也有研究利用組織化學(xué)和其他技術(shù)辨認(rèn)出離層細(xì)胞的特點(diǎn)[5]。

許多研究表明，纖維素酶、多聚半乳糖醛酸酶等細(xì)胞壁降解酶活性與離區(qū)脫落進(jìn)程有著密切的關(guān)系[6-10]。國(guó)內(nèi)對(duì)番茄的離層產(chǎn)生已進(jìn)行一些研究，但其作用機(jī)制尚不十分明確，尤其是有、無(wú)離層間纖維素酶與多聚半乳糖醛酸酶等酶的活性變化報(bào)道更少，并且離層在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)與模式植物研究等方面具有重要價(jià)值。許多研究者對(duì)植物器官脫落進(jìn)行深入研究，而對(duì)番茄花梗離區(qū)形成過(guò)程則關(guān)注較少。

因此，本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)番茄花發(fā)育過(guò)程中離層形成的解剖觀察，對(duì)離層的特性及其形成的解剖學(xué)過(guò)程進(jìn)行研究，并以花完全開(kāi)放時(shí)期的離區(qū)為生理生化研究對(duì)象，研究番茄花梗脫落區(qū)發(fā)育過(guò)程中相關(guān)細(xì)胞壁降解酶含量的變化，為進(jìn)一步探討離區(qū)發(fā)育機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)，也為生產(chǎn)中防止落花落果提供重要指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)于2009年2～7月在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝站進(jìn)行，以番茄離層品種“08052”、“09872”、“09874”和無(wú)離層品種“08003”、“08004”、“08016”為試材，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)番茄課題組提供，日光溫室栽培。當(dāng)番茄開(kāi)第2穗花時(shí)開(kāi)始取樣，于每天上午9:00左右剪取各株相同或相近位置花序上正常開(kāi)放的花，放入盛有蒸餾水的燒杯中，立即帶回實(shí)驗(yàn)室，先用自來(lái)水沖洗，再用蒸餾水沖洗3次。取有離層品種離區(qū)上下2 cm作為提取材料，無(wú)離層品種在相應(yīng)部位2 cm處取材。

1.2 方法

1.2.1 離層發(fā)育過(guò)程解剖學(xué)研究

在6葉1心時(shí)取有離層品種“9872”（T）和對(duì)照無(wú)離層品種“08003”（CK），每7 d取其生長(zhǎng)點(diǎn)，至花絮出現(xiàn)時(shí)取其花絮，待花完全開(kāi)時(shí)取其花梗，均用FAA固定。利用石蠟切片技術(shù)處理所取樣品（切片厚度為10 μm）經(jīng)過(guò)番紅-固綠滴染后封固[11]，用Olympus-BMF光學(xué)顯微鏡觀察并選擇典型的結(jié)構(gòu)進(jìn)行拍照。

1.2.2 生理生化指標(biāo)的測(cè)定

根據(jù)離層發(fā)育過(guò)程解剖學(xué)觀察結(jié)果，在完全形成離層的時(shí)期（花完全開(kāi)放時(shí)期）進(jìn)行取材，測(cè)定相關(guān)的生理生化指標(biāo)。

多聚半乳糖醛酸酶：0.6%柑橘果膠為反應(yīng)底物，每克組織每小時(shí)內(nèi)黏度下降1%作為一個(gè)Exo-PG酶活單位[12]。

纖維素酶：羧甲基纖維素鈉為底物，采用3，5-二硝基水楊酸比色法[13]。以每小時(shí)生成1 mg的還原糖作為1個(gè)酶活單位。

果膠甲酯酶：0.5%果膠溶液為底物，采用吸光光度法測(cè)量，一個(gè)酶活力單位被定義為每分鐘釋放1 μmol的甲酯所需要的酶量。

可溶性蛋白含量采用考馬斯亮蘭法測(cè)定。

數(shù)據(jù)利用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄花梗離區(qū)過(guò)程解剖學(xué)分析

番茄種子發(fā)芽后，繼續(xù)保持營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，當(dāng)長(zhǎng)到7～8片真葉時(shí)，生長(zhǎng)點(diǎn)就停止了葉的分化開(kāi)始進(jìn)入花芽分化。由圖版Ⅰ-1和Ⅰ-2可以看出，這時(shí)期的芽還不能分辨出是花芽還是葉芽，且有離層品種與無(wú)離層品種間也無(wú)差別。

由于花芽芽體肥大飽滿(mǎn)，頂端圓鈍，而葉芽則芽體較小，頂端細(xì)長(zhǎng)。由圖版Ⅰ-3和Ⅰ-4可看出，此時(shí)的生長(zhǎng)點(diǎn)呈圓錐形突起，且生長(zhǎng)點(diǎn)頂部肥厚隆起，上端扁平，此時(shí)的芽原基開(kāi)始形成花芽，植株進(jìn)入花芽分化初期，開(kāi)始從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期轉(zhuǎn)入到生殖生長(zhǎng)時(shí)期。在花芽分化初期離層分化不明顯，基本上還未開(kāi)始進(jìn)行離層的分化。

當(dāng)番茄花芽分化進(jìn)入中期時(shí)，無(wú)離層品種的花芽梗和有離層品種的花芽梗在解剖學(xué)有一定差異。由圖版Ⅰ-5和Ⅰ-6可以看出，無(wú)離層品種花芽梗中部發(fā)育平滑無(wú)任何斷帶，而有離層品種花芽梗中部有一條隱約可見(jiàn)的斷帶。

隨著花的發(fā)育，當(dāng)番茄花芽分化進(jìn)入后期時(shí)，無(wú)離層品種花梗細(xì)胞排列都非常有序，并無(wú)斷層出現(xiàn)（見(jiàn)圖版Ⅰ-7）；而有離層品種花梗中部的斷帶也變得清晰可見(jiàn)（見(jiàn)圖版Ⅰ-8），這說(shuō)明離層也是隨著花的發(fā)育而逐步形成的。

當(dāng)番茄花完全開(kāi)放時(shí)（見(jiàn)圖版Ⅰ-9和Ⅰ-10），無(wú)離層品種的花梗細(xì)胞排列緊密有序并無(wú)斷層出現(xiàn)（見(jiàn)圖版Ⅰ-11）；而有離層品種的花梗發(fā)育膨大，離層凹陷變得更明顯且斷帶更加清晰，斷帶是由比周?chē)《颐艿募?xì)胞組成的，此斷帶就是我們所說(shuō)的離層（見(jiàn)圖版Ⅰ-12）。而且從植株外觀上可以看出，有離層品種花梗上有膨大的結(jié)，中央有一圈凹陷，此區(qū)域就是離區(qū)（見(jiàn)圖版Ⅰ-12），但無(wú)離層品種的花梗沒(méi)有這種結(jié)（見(jiàn)圖版Ⅰ-11）。

2.2 花梗離區(qū)部位生理指標(biāo)的測(cè)定

2.2.1 有離層品種與無(wú)離層品種離區(qū)部位多聚半乳糖醛酸酶含量的差別

多聚半乳糖醛酸酶與離層的產(chǎn)生有著重要關(guān)系。由圖1可知，不僅無(wú)離層品種（08003、08004、08016）間多聚半乳糖醛酸酶含量差異不顯著，而且離層品種（08052、09872、09874）間多聚半乳糖醛酸酶含量差異也不顯著。然而離層品種多聚半乳糖醛酸酶活性顯著高于無(wú)離層品種，說(shuō)明多聚半乳糖醛酸酶含量高可以促使離層的產(chǎn)生。

圖版I 有離層品種與無(wú)離層品種離區(qū)解剖結(jié)構(gòu)對(duì)比Plate I Abscission zone anatomy structural comparison between cultivars with and without abscission layers

圖1 有離層品種與無(wú)離層品種離區(qū)部位多聚半乳糖醛酸酶活性Fig.1 Poly-galacturonic acid activity in abascission zone of cultivars with and without abscission layers

2.2.2 有離層品種與無(wú)離層品種花梗的纖維素酶含量的差別

纖維素酶在細(xì)胞壁的酶解進(jìn)程中起著重要作用，從而促使離層的產(chǎn)生。由圖2可知，無(wú)論是無(wú)離層品種（08003、08004、08016），還是離層品種（08052、09872、09874），它們的纖維素酶活性差異均不顯著。然而離層品種與無(wú)離層品種的纖維素酶活性差異顯著，且離層品種花梗的纖維素酶活性顯著高于無(wú)離層品種。

2.2.3 有離層品種與無(wú)離層品種離區(qū)部位果膠甲酯酶活性的差別

果膠甲酯酶的作用是去除果膠分子鏈上半乳糖醛酸基上的酯化基團(tuán)，增加果膠在水中的溶解度，降解細(xì)胞壁。由圖3可知，同花梗的纖維素酶活性一樣，無(wú)離層品種（08003、08004、08016）間果膠甲酯酶活性差異不顯著，離層品種（08052、09872、09874）間果膠甲酯酶活性差異顯著。然而離層品種與無(wú)離層品種中的果膠甲酯酶活性呈差異顯著，且其活性明顯高于無(wú)離層品種。

2.2.4 有離層品種與無(wú)離層品種可溶性蛋白含量的差別

由圖4可知，雖然無(wú)離層品種（08003、08004、08016）間可溶性蛋白含量差異顯著，有離層品種（08052、09872、09874）間的可溶性蛋白含量差異不顯著。但無(wú)離層品種可溶性蛋白含量要高于有離層品種。

圖2 有離層品種與無(wú)離層品種離區(qū)部位纖維素酶活性Fig.2 Ce11u1ase activity in the abascission zone of cultivars with and without abscission layers

圖3 有離層品種與無(wú)離層品種離區(qū)部位果膠甲酯酶活性Fig.3 Pectin methylesterase activity in the abscission zone of cultivars with and without abscission layers

圖4 有離層品種與無(wú)離層品種離區(qū)部位可溶性蛋白含量Fig.4 Content of soluble protein in the abscission zone in cultivars with and without abscission layers

3 討論與結(jié)論

脫落與離層密切相關(guān)，器官的脫落必有離層的產(chǎn)生，但有離層的器官不一定會(huì)有脫落現(xiàn)象的發(fā)生。由本試驗(yàn)可以看出，離層始終是伴隨著花的產(chǎn)生，花的開(kāi)放乃至結(jié)果。分化程度作為一種重要的脫落前提存在[14-15]。

由解剖圖片可知，離層是由數(shù)層小細(xì)胞組成的一個(gè)完整的貫穿整個(gè)花梗部位的細(xì)胞層。曾經(jīng)有人認(rèn)為離層就是原本脆弱的連接點(diǎn)，后來(lái)經(jīng)過(guò)測(cè)定誘導(dǎo)初期脫落器官或組織的折斷強(qiáng)度變化，發(fā)現(xiàn)事實(shí)并非如此[16]。在試驗(yàn)取材、處理材料的過(guò)程中，花梗的離層處基本上都不斷裂，這點(diǎn)證明了離層并不是脆弱的連接點(diǎn)。對(duì)多種園藝植物花器離區(qū)的解剖顯示，不同植物花器離層細(xì)胞大小有3種類(lèi)型：①離層細(xì)胞比鄰近細(xì)胞小，大多等徑[17]，②離層細(xì)胞比鄰近細(xì)胞小，大多長(zhǎng)方形；③離層細(xì)胞大小與相鄰細(xì)胞近似[18]。不同植物細(xì)胞大小為何不同，到底有何作用尚需要進(jìn)一步探討。

本試驗(yàn)先通過(guò)解剖學(xué)來(lái)初步認(rèn)識(shí)和了解離層的產(chǎn)生過(guò)程，通過(guò)測(cè)定加工番茄花期離層部位生理生化各指標(biāo)的差異來(lái)進(jìn)一步研究細(xì)胞壁降解酶及可溶性蛋白對(duì)離區(qū)的影響。由試驗(yàn)可知，無(wú)離層品種（08003、08004、08016）間的各細(xì)胞壁降解酶活性差異不顯著，且其活性較低，說(shuō)明無(wú)離層品種花梗部位該酶的表達(dá)量較少，未達(dá)到對(duì)花梗細(xì)胞產(chǎn)生影響。離層品種（08052、09872、09874）間的細(xì)胞壁降解酶的活性個(gè)別有差異性，這是品種所特有的差異造成的。但這并不影響與無(wú)離層品種的對(duì)照研究，PG、纖維素酶和果膠甲酯酶的活性在離層品種中是在無(wú)離層品種中活性的5倍左右，正是由于離層品種中有如此高活性的酶作用于離區(qū)細(xì)胞，所以能夠清晰看到與周?chē)?xì)胞不同的離層。此外研究者認(rèn)為，花梗離層是由復(fù)雜的細(xì)胞壁降解酶系統(tǒng)共同作用結(jié)果，非由少數(shù)幾種酶單獨(dú)完成[19]，了解這個(gè)酶系統(tǒng)的成員及其作用順序是了解離層特性的必要步驟。

本試驗(yàn)所測(cè)的有無(wú)離層品種可溶性蛋白含量的變化趨勢(shì)完全與酶活含量相反，可溶性蛋白的含量與細(xì)胞壁降解酶的活性呈負(fù)相關(guān)，其原因有待于進(jìn)一步研究。

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