分子分型時(shí)代的肺癌治療個(gè)體化趨勢(shì)

陳海泉

復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院胸外科，復(fù)旦大學(xué)肺癌防治中心，復(fù)旦大學(xué)上海藝學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032

肺癌是世界范圍內(nèi)病死率第一位的惡性腫瘤。根據(jù)《2010中國(guó)衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)年鑒》，我國(guó)2009年肺癌死亡率為30.83/10萬(wàn)人，高居所有惡性腫瘤之首。肺癌可以分為非小細(xì)胞肺癌和小細(xì)胞肺癌，其中非小細(xì)胞肺癌占所有肺癌的80%。非小細(xì)胞肺癌又可以分為腺癌、鱗癌和大細(xì)胞癌。近年來(lái)肺腺癌在非小細(xì)胞肺癌中所占的比例不斷上升，已成為最常見(jiàn)的肺癌亞型。特別是在不吸煙的肺癌患者中，肺腺癌的比例高達(dá)70%，因?yàn)樵缙陔y以發(fā)現(xiàn)，且晚期治療預(yù)后極差，給社會(huì)帶來(lái)了極大的負(fù)擔(dān)。

包括腺癌在內(nèi)，肺癌是一系列由多種不同分子遺傳學(xué)機(jī)制異常造成細(xì)胞分化、周期調(diào)控、衰老及凋亡等多種生物學(xué)行為失調(diào)，最終導(dǎo)致癌變的疾病的總和?！敖獯a”肺癌，特別是肺腺癌的發(fā)病機(jī)制，從分子遺傳和分子生物學(xué)層面對(duì)腫瘤自然病程的發(fā)生、發(fā)展機(jī)理進(jìn)行探索是研究肺癌的基礎(chǔ)，也是肺癌領(lǐng)域科研的前沿。由于肺腺癌分子生物學(xué)機(jī)制的復(fù)雜多樣，以尋找“生物標(biāo)志”為主要手段的一類轉(zhuǎn)化型研究日益凸顯出巨大的價(jià)值。該類研究通過(guò)在核酸、蛋白及微環(huán)境因子等多層面尋找腫瘤相關(guān)特異的生物標(biāo)志，對(duì)具有不同易感因素、致病機(jī)制和治療敏感性的人群加以區(qū)別，從而實(shí)現(xiàn)高危篩查、早期診斷、個(gè)體化治療和預(yù)后判斷等。因此該領(lǐng)域的轉(zhuǎn)化型研究在腫瘤生物學(xué)、臨床腫瘤學(xué)、公共衛(wèi)生及衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)學(xué)方面都具有重要的科學(xué)、社會(huì)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

癌癥目前被認(rèn)為是一個(gè)多基因累積突變的多步驟過(guò)程，基因突變是腫瘤產(chǎn)生、發(fā)展的根本原動(dòng)力?；蛲蛔儼?qū)動(dòng)突變(driver mutation)和伴隨突變(passenger mutation)；驅(qū)動(dòng)突變間相互排斥，即一種突變即可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，成為了遺傳水平的“腫瘤生物標(biāo)志”最佳選擇。目前根據(jù)已知的驅(qū)動(dòng)突變的研究已經(jīng)可以明確50%肺腺癌患者的突變類型、建立組織學(xué)類型下的分子亞型；并且已經(jīng)直接對(duì)臨床醫(yī)學(xué)貢獻(xiàn)出了巨大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值(一系列極具前景的靶向藥物已經(jīng)FDA批準(zhǔn)上市，如對(duì)應(yīng)EGFR突變的靶向藥物厄羅替尼、吉非替尼和對(duì)應(yīng)EML4-ALK融合基因的crizotinib等)；基因突變的分析為藥品研發(fā)、個(gè)體化治療展開(kāi)了廣闊的藍(lán)圖。通過(guò)“分子診斷”，還可以將同一種病理類型的肺癌進(jìn)一步劃分為多種“分子亞型”，并通過(guò)選擇相應(yīng)的“分子靶向藥物”使患者得到更加個(gè)體化的治療。

復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院展開(kāi)了基于中國(guó)人群肺腺癌已知突變的廣泛研究，通過(guò)收集 超過(guò)腫瘤組織和配對(duì)正常肺組織，經(jīng)過(guò)核酸抽提、聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)直接測(cè)序、熒光原位雜交(FISH)、免疫組化、基因芯片和生物信息學(xué)分析等技術(shù)和手段對(duì)包括EGFR、KRAS、EML4-ALK、ER2/ERBB2等在內(nèi)的已知突變進(jìn)行綜合分析，揭示了以中國(guó)人為代表的東亞肺腺癌人群，特別是不吸煙女性人群的基因突變規(guī)律，并進(jìn)一步提示了突變基因作為“生物標(biāo)志”在腫瘤診斷、分期以及個(gè)體化治療等方面的直接或潛在價(jià)值。

1 肺癌分子分型研究進(jìn)展

1.1 中國(guó)人群肺腺癌EGFR突變的分析

一般認(rèn)為，肺腺癌表皮生長(zhǎng)因子受體(epithelial growth factor receptor，EGFR)突變東方人群高于西方、非吸煙者高于吸煙者。有研究證實(shí)EGFR突變與戒煙時(shí)間、腫瘤分期和組織學(xué)類型等相關(guān)［1］。但對(duì)于東、西方人群間非吸煙腺癌患者EGFR突變情況的比較尚無(wú)定論，特別是非吸煙的男性和女性患者間EGFR突變是否存在差異一直缺乏有力結(jié)論。復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院對(duì)224例中國(guó)肺腺癌患者(男性114例，女性110例)進(jìn)行了EGFR突變的檢測(cè)，通過(guò)總體和亞組分析發(fā)現(xiàn)：中國(guó)人肺腺癌樣本中EGFR突變的特征與歐美人報(bào)道的有差異，我國(guó)肺腺癌患者中不吸煙患者發(fā)生EGFR突變的比例高，并且性別差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)［2］。進(jìn)一步研究顯示：中國(guó)女性不吸煙肺腺癌患者的突變類型與年齡及腺癌病理亞型相關(guān)(圖1)［3］。

1.2 中國(guó)非吸煙人群肺腺癌已知突變的分析

在肺腺癌患者中，不吸煙的患者占有很大的比重。既往基礎(chǔ)和IPASS等臨床研究表明不吸煙患者的肺腺癌是一類具有特殊分子病理學(xué)特點(diǎn)的疾病，特別是東亞不吸煙女性對(duì)于靶向治療具有較好的反應(yīng)，因此東亞不吸煙肺腺癌人群的突變水平是世界關(guān)注的焦點(diǎn)。因此，復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院通過(guò)分析52例中國(guó)不吸煙肺腺癌中的常見(jiàn)致癌基因突變結(jié)果，提出中國(guó)不吸煙肺腺癌患者大部分都具有已知驅(qū)動(dòng)突變，并且目前多數(shù)突變位點(diǎn)都有相應(yīng)的靶向藥物治療，這為癌癥的“個(gè)體化治療”奠定了理論依據(jù)(圖2)［4］。

圖1 中國(guó) 女性不吸煙肺腺癌患者的突變類型與年齡及腺癌病理亞型的相關(guān)性分析

圖2 中國(guó)不 吸煙肺腺癌患者突變分析

1.3 非小細(xì)胞肺癌新的分子亞型—RET融合基因

復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院準(zhǔn)確描述并定義了非小細(xì)胞肺癌中一項(xiàng)新的分子亞型—RET融合基因及其獨(dú)特的臨床病理特征，同時(shí)提出了一種高效、準(zhǔn)確的RET融合基因檢測(cè)方法［5］，解決了國(guó)際上RET融合基因檢測(cè)的難題。

復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院對(duì)936例非小細(xì)胞肺癌進(jìn)行了包括EGFR、KRAS、BRAF、HER-2、ALK和RET在內(nèi)的全面的分子診斷和分型分析，發(fā)現(xiàn)RET融合基因存在于1.4%的非小細(xì)胞肺癌患者，并且這些患者表現(xiàn)出不吸煙者多見(jiàn)、低分化為主等一系列獨(dú)特的臨床和病理學(xué)特征；此外RET融合基因與其他已知的非小細(xì)胞肺癌分子亞型相互獨(dú)立、不重疊，進(jìn)而可以將RET融合基因定義為非小細(xì)胞肺癌中的一項(xiàng)新的分子亞型。

該研究提出一種高效、準(zhǔn)確、低廉的RET融合基因檢測(cè)方法：基于表達(dá)不平衡的RET融合基因檢測(cè)法。目前國(guó)際上已有數(shù)種多靶點(diǎn)分子靶向藥物可為具有RET融合基因的患者提供個(gè)體化治療。該研究對(duì)RET融合基因患者臨床病理特征的準(zhǔn)確描述以及高效RET融合基因分子檢測(cè)方法的發(fā)明，將為這些藥物的后期臨床試驗(yàn)的實(shí)現(xiàn)發(fā)揮價(jià)值。非小細(xì)胞肺癌中RET融合基因的發(fā)現(xiàn)令人興奮，不但增添我們對(duì)這種惡性腫瘤背后機(jī)制的深入了解，還將可能為這一類型患者提供有效的治療手段。這些分子檢測(cè)方法的進(jìn)步，將使得對(duì)患者的診斷更加便捷。

1.4 ALK融合基因檢測(cè)新技術(shù)

作為肺癌分子亞型的一種，ALK融合基因存在于3%～7%的非小細(xì)胞肺癌中，以ALK融合基因?yàn)榘悬c(diǎn)的分子靶向藥物Crizotinib顯著提高了攜帶有該融合基因的肺癌患者的生存，并在2011年被美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于一線治療ALK融合基因陽(yáng)性的晚期非小細(xì)胞肺癌患者。目前ALK融合基因檢測(cè)的主要方法包括熒光原位雜交(FISH)，以及免疫組化和逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈技術(shù)(RT-PCR)等。FISH被認(rèn)為是“金標(biāo)準(zhǔn)”，但其技術(shù)復(fù)雜，整個(gè)過(guò)程至少需要2 d，檢測(cè)效率低下，并且價(jià)格不菲(約1500美元/例)。免疫組化方法敏感性較高但特異性過(guò)低，RT-PCR方法特異性較高但敏感性過(guò)低，因而都未能在臨床中大規(guī)模應(yīng)用。

復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院對(duì)ALK融合基因的檢測(cè)研究發(fā)現(xiàn)：ALK基因發(fā)生斷裂后激酶域表達(dá)顯著增高，而非激酶域不表達(dá)或低表達(dá)。進(jìn)而發(fā)展出了“基于qPCR的ALK融合基因檢測(cè)”的新技術(shù)，即采用實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)的方法檢測(cè)斷裂點(diǎn)前后ALK 基因的表達(dá)水平，通過(guò)其水平差異實(shí)現(xiàn)ALK融合基因快速準(zhǔn)確的診斷。在一項(xiàng)對(duì)654例非小細(xì)胞肺癌標(biāo)本的分析中，使用該檢測(cè)手段檢測(cè)發(fā)現(xiàn)40例ALK融合基因陽(yáng)性標(biāo)本，經(jīng)過(guò)“金標(biāo)準(zhǔn)”—FISH驗(yàn)證，該技術(shù)的敏感性、特異性均達(dá)到100%(圖3)，顯著優(yōu)于免疫組化、RT-PCR等其他技術(shù)［6］。除此之外，該技術(shù)還具有高通量、低成本等其他技術(shù)難以比擬的優(yōu)勢(shì)：利用該技術(shù)在90 min內(nèi)即可實(shí)現(xiàn)對(duì)48例樣本的檢測(cè)，而每例樣本的檢測(cè)成本不超過(guò)30元。

圖3 基于qPCR的ALK融合基因檢測(cè)與FISH結(jié)果完全吻合

在臨床的實(shí)際應(yīng)用中，該技術(shù)可以低價(jià)、快速地得到ALK融合基因初步檢測(cè)結(jié)果，不但可以節(jié)省檢測(cè)費(fèi)用，更為“惜時(shí)如金”的晚期患者診療贏得更多時(shí)間；同時(shí)，該技術(shù)所需的儀器設(shè)備極為普通、簡(jiǎn)單，因此很易于在各級(jí)醫(yī)療科研單位中進(jìn)行普及推廣；此外，該技術(shù)高通量的特點(diǎn)為大規(guī)模臨床試驗(yàn)的患者篩選、分子流行病調(diào)查提供了極其便利的手段。

該研究被授予阿爾弗雷德·索弗研究獎(jiǎng)(Alfred Soffer Research Award)；2012年9月1日，國(guó)際著名腫瘤學(xué)期刊《Cancer Research》將該研究譽(yù)為“突破性進(jìn)展(breaking advances)”，并專門刊文進(jìn)行報(bào)道。

1.5 肺腺癌EGFR突變與EGFR基因擴(kuò)增的關(guān)聯(lián)

一直以來(lái)EGFR TKI靶向藥物的選擇依據(jù)除EGFR突變外還包括EGFR基因擴(kuò)增和免疫組化EGFR陽(yáng)性。復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院還對(duì)我國(guó)肺腺癌患者中EGFR突變陽(yáng)性者的EGFR拷貝數(shù)變化進(jìn)行了研究。通過(guò)FISH或者基因芯片SNP6.0檢測(cè)肺腺癌中EGFR的拷貝數(shù)，發(fā)現(xiàn)EGFR的拷貝數(shù)明顯與EGFR突變相關(guān)［7］。

1.6 肺腺癌HER-2突變與HER-2/EGFR基因擴(kuò)增的關(guān)聯(lián)

EGFR即HER-1，與HER-2同為驅(qū)動(dòng)突變，并且在肺癌和乳腺癌中均有相應(yīng)的靶向治療藥物對(duì)應(yīng)；女性乳腺癌中HER-2陽(yáng)性較多，而肺腺癌中EGFR陽(yáng)性相對(duì)較多。作為肺腺癌的一個(gè)較少的突變亞型，復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院在HER-2突變肺腺癌患者中分析了其突變與HER-2及EGFR基因擴(kuò)增間的關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)HER-2陽(yáng)性的肺腺癌伴有明顯的HER-2或EGFR基因拷貝數(shù)增長(zhǎng)，顯示兩者在發(fā)病機(jī)制間的關(guān)聯(lián)，提示未來(lái)對(duì)于肺腺癌HER-2陽(yáng)性的患者進(jìn)行聯(lián)合靶向治療的可能［8］。

1.7 其他肺腺癌驅(qū)動(dòng)突變的研究

有研究證明LKB1通過(guò)細(xì)胞外基質(zhì)重塑等機(jī)制抑制肺癌進(jìn)展［9］，復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院又進(jìn)一步分析了肺腺癌中LKB1、EGFR和KRAS基因突變的特征，在國(guó)際上首次報(bào)道了中國(guó)人肺癌的LKB1突變分析結(jié)果［10］。ROS1融合基因的國(guó)際合作研究結(jié)果在世界范圍內(nèi)首次證實(shí)ROS1融合基因是肺癌中一項(xiàng)獨(dú)立的突變亞型［11］。

上述研究在遺傳分子水平進(jìn)一步揭示了肺癌的發(fā)病機(jī)制，展示了東亞人群特別是不吸煙人群肺腺癌的分子遺傳學(xué)輪廓，為針對(duì)這一大類患者的臨床研究提供了理論依據(jù)，為臨床靶向治療提供選擇依據(jù)，為尋找新的治療靶點(diǎn)和新的靶向藥物提供方向。

2 非小細(xì)胞肺癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)

非小細(xì)胞肺癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的狀況是明確患者分期的重要關(guān)鍵點(diǎn)，對(duì)于患者個(gè)體化治療方案的選擇及預(yù)后判斷具有重要意義。

CT上未顯示淋巴結(jié)腫大的T1期非小細(xì)胞肺癌由于N2淋巴結(jié)累及的概率相對(duì)較低，是否常規(guī)使用縱隔鏡或者PET檢查尚存在爭(zhēng)議。復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院回顧性分析了530例CT診斷為T1N0的非小細(xì)胞肺癌患者接受手術(shù)切除與系統(tǒng)性淋巴結(jié)清掃的情況，使用單因素分析和多因素logistic回歸來(lái)評(píng)估臨床病理資料與N2淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的聯(lián)系。結(jié)果顯示N2淋巴結(jié)累及率為16.8%。通過(guò)logistic回歸發(fā)現(xiàn)了4個(gè)獨(dú)立預(yù)測(cè)N2疾病的因素：較年輕的年齡(OR＝0.974，95%CI，0.952～0.997)、較大的腫瘤直徑(OR＝2.769，95%CI：1.818～4.217)、中央型腫瘤(OR＝3.204，95%CI：1.512～6.790)以及侵襲性腺癌的組織學(xué)類型(OR＝3.537，95%CI：1.740～7.191)。這一預(yù)測(cè)模型具有較好的吻合度(Hosmer-Lemeshow檢驗(yàn)：P=0.784)、較好的鑒別度(ROC曲線下面積為0.726，95%CI：0.669～0.784)以及經(jīng)Bootstrapping檢驗(yàn)證實(shí)的較低的“過(guò)擬合”。這一預(yù)測(cè)模型有助于預(yù)測(cè)縱隔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，進(jìn)而協(xié)助臨床決策［12］。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外許多 研究都致力于在原發(fā)灶直徑較小的肺癌中找到可靠的預(yù)測(cè)淋巴結(jié)N0的因素，以明確系統(tǒng)性淋巴結(jié)清掃的必要性。對(duì)原發(fā)灶直徑≤1 cm的患者是否需行系統(tǒng)性淋巴結(jié)清掃尚存在較大爭(zhēng)議。

復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院回顧性分析了243例周邊型小腫塊(直徑≤2 cm)非小細(xì)胞肺癌病例中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)的因素［13］。這些小腫塊的直徑都在新鮮標(biāo)本中測(cè)量(在4%的甲醛溶液固定之前)。腺癌的亞型根據(jù)2011年版的IASLC/ATS/ERS腺癌分類方法進(jìn)行歸類。結(jié)果顯示N1和N2淋巴結(jié)累及率分別為5.3%和6.6%。在直徑≤1 cm的腫塊中也發(fā)現(xiàn)有N2淋巴結(jié)累及(2/53，3.8%)。在鱗癌、腺癌中的原位腺癌、微侵潤(rùn)腺癌、貼壁亞型以及侵襲性粘液腺癌中未見(jiàn)淋巴結(jié)累及。以上5種組織類型占所有周圍型小直徑非小細(xì)胞肺癌的34.6%。因而通過(guò)組織學(xué)分型，在超過(guò)1/3的周圍型小直徑非小細(xì)胞肺癌中可不進(jìn)行系統(tǒng)性淋巴結(jié)清掃。

3 展望

目前轉(zhuǎn)化研究主要針對(duì)肺腺癌患者開(kāi)展，檢測(cè)范疇也僅限于目前世界上所發(fā)現(xiàn)的已知驅(qū)動(dòng)突變。而肺腺癌總體仍有50%無(wú)法確定其驅(qū)動(dòng)突變，限制了這部分患者接受個(gè)體化診治的可能。此外與肺腺癌相比，肺鱗癌的個(gè)體化治療更加是一片較難開(kāi)墾的處女地，也潛藏著巨大機(jī)遇。進(jìn)一步的研究將聚焦未見(jiàn)已知突變(pan-negative)的肺癌，探索其發(fā)病機(jī)制，提供分子生物學(xué)標(biāo)志，為患者診斷與個(gè)體化治療提供依據(jù)將成為研究熱點(diǎn)。此外，隨著“全基因組時(shí)代”的逐漸到來(lái)，通過(guò)高通量全基因組(外顯子)測(cè)序技術(shù)探索未知的突變并進(jìn)行功能的鑒定，將可能極大地推進(jìn)肺癌基礎(chǔ)研究領(lǐng)域的進(jìn)步，使肺癌的個(gè)體化治療更上一個(gè)臺(tái)階。

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