前列腺癌靶向基因治療實(shí)驗(yàn)研究的最新進(jìn)展

潘東亮 綜述 那彥群 審校

北京大學(xué)首鋼醫(yī)院泌尿外科，北京大學(xué)吳階平泌尿外科醫(yī)學(xué)中心，北京100144

由于去勢抵抗性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer，CRPC)缺乏有效的治療方法催生了探索新治療模式的需求，其中靶向基因治療是治療前列腺癌較理想的模式，既可單獨(dú)使用也可與其他方法聯(lián)合應(yīng)用。但因缺乏令人滿意的基因載體以及旁觀者效應(yīng)的降低而影響了其臨床應(yīng)用，因此世界各地的科學(xué)家進(jìn)一步致力于靶向基因、載體、應(yīng)用方法和治療方案的研究。

1 靶向基因

單純皰疹病毒(herpes simplex virus，HSV)- 腺苷激酶(thymidine kinase，TK)/更昔洛韋(ganciclovir，GCV)系統(tǒng)是前列腺癌治療領(lǐng)域中應(yīng)用最廣泛的自殺式基因之一，但是其效果有限。為此，Chen等［1］嘗試構(gòu)建了雙靶向的新型基因系統(tǒng)：即由前列腺特異性膜抗原(prostatespecific membrane antigen，PSMA)驅(qū)動(dòng)的表達(dá)HSV-TK和connexin43(Cx43)基因的第五代非病毒載體G5-PAMAM-D(generation 5 polyamidoamine dendrimers)，通過一系列體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，G5-PAMAM-D 可以有效地向前列腺癌PC-3細(xì)胞輸送重組質(zhì)粒，HSV-TK和Cx43在前列腺癌細(xì)胞內(nèi)均能成功表達(dá)；G5-PAMAM-D能有效誘導(dǎo)前列腺癌PC-3細(xì)胞凋亡，抑制癌細(xì)胞生長，降低瘤體增長速度；當(dāng)與吉西他濱聯(lián)用時(shí)則可以引起更多的前列腺癌細(xì)胞凋亡。

大腸桿菌嘌呤核苷磷酸(purine nucleoside phosphorylase，PNP)是最新發(fā)現(xiàn)的自殺式基因，而且PNP/氟達(dá)拉濱可被前列腺特異性的鼠probasin為基礎(chǔ)的啟動(dòng)子ARR2PB 輸送。被腺病毒(adenovirus，ADV)·ARR2PB-PNP轉(zhuǎn)染后的前列腺癌細(xì)胞在雄激素類似物R1881存在的情況下對低濃度氟達(dá)拉濱(LD50，0.1 μg/mL)即敏感，而且旁觀者效應(yīng)比ADV-巨細(xì)胞病毒(cytomegalovirus，CMV)-HSV-TK/GCV強(qiáng)。ADV·ARR2PB-PNP/氟達(dá)拉濱治療組的瘤體明顯小于對照組，且存活時(shí)間顯著延長，甚至部分鼠存活時(shí)間達(dá)到160 d，且沒有全身不良反應(yīng)［2］。細(xì)胞周期G2/M 期基因UBE2C是CRPC特異性雄激素受體(androgen receptor，AR)靶基因，是CRPC生長必需的。細(xì)胞周期G1/S期抑制劑-779可以抑制AR陽性CRPC細(xì)胞模型abl和C4-2B中UBE2C mRNA和蛋白表達(dá)，涉及的分子機(jī)制是：減少AR共激動(dòng)子SRC1、SRC3、p300、MED1與UBE2C增強(qiáng)子的結(jié)合，導(dǎo)致RNA多聚酶Ⅱ供給UBE2C增強(qiáng)子減少和UBE2C mRNA穩(wěn)定性衰減，進(jìn)而顯著降低UBE2C依賴性癌細(xì)胞增殖和侵襲［3］。因此，提示UBE2C有望成為前列腺癌基因治療的新靶點(diǎn)。

Sec62是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上蛋白轉(zhuǎn)位工具的組成部分，在前列腺癌患者的癌組織內(nèi)Sec62蛋白水平升高，這與癌細(xì)胞的再分化程度增高有關(guān)。沉默前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3的Sec62基因后，癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵潤力被阻斷或顯著性降低，但是癌細(xì)胞活力幾乎不受影響，因此Sec62基因可作為腫瘤治療的靶向基因［4］。另外，被以腺病毒為載體的ADV-CMV-NDRG2(N-myc downstreamregulated gene 2，N-myc 下游調(diào)控基因-2)感染后的前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3增殖受到顯著抑制，提示NDRG2可成為前列腺癌基因治療的靶點(diǎn)；但是NDRG2在增生的前列腺組織內(nèi)高表達(dá)，而在前列腺癌組織內(nèi)的表達(dá)水平很低［5］，所以NDRG2基因的實(shí)際應(yīng)用前景不樂觀。

基因FABP5編碼皮膚脂肪酸結(jié)合蛋白，在前列腺癌中上調(diào)，扮演了癌基因的角色。小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)定靶FABP5后的atelocollagen懸浮液被注射在BALB/c裸鼠前列腺癌PC-3M瘤體周圍，發(fā)現(xiàn)10和15 μmol/L siRNA治療組的平均瘤體的體積是對照組的1/3；而與加擾siRNA治療組相比，10 μmol/L FABP5 siRNA緩沖液和1或5 μmol/L siRNA的atelocollagen懸浮液差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。盡管15 μmol/L的siRNA比10 μmol/L能更大幅度地縮小腫瘤體積，但兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。10和15 μmol/L劑量治療的瘤體內(nèi)C-FABP表達(dá)水平低于其他組，顯示借助atelocollagen液注射到前列腺癌周圍的FABP5 siRNA能有效抑制裸鼠前列腺癌細(xì)胞生長，當(dāng)劑量>10 μmol/L時(shí)則呈效果-劑量正相關(guān)［6］。

分化顯示編碼3(differential display code 3，DD3)是最多見的前列腺癌特異性基因之一。應(yīng)用微小DD3啟動(dòng)子代替病毒原有啟動(dòng)子E1A基因構(gòu)建溶瘤腺病毒Ad·DD3-E1A，再配以治療性基因白介素(interleukin，IL)-24增強(qiáng)它的抗腫瘤活性，形成腺病毒Ad·DD3-E1A-IL-24，兼具前列腺特異性和出色的抗腫瘤活性，能通過誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞凋亡和抑制血管生成機(jī)制發(fā)揮抗腫瘤作用，因此未來Ad·DD3-E1A-IL-24也可以用于前列腺癌的治療［7］。

Shao等［8］研究發(fā)現(xiàn)，在50%以上的前列腺癌細(xì)胞里表達(dá)TMPRSS2/ERG融合基因。通過脂質(zhì)體納米載體輸送的高特異性siRNAs治療鼠原位和皮下前列腺癌，結(jié)果顯示此介質(zhì)輸送的高特異性siRNAs治療作用強(qiáng)，且特異性高，抑制腫瘤生長的程度與融合基因的敲除程度呈正相關(guān)，無不良反應(yīng)。因此，TMPRSS2/ERG融合基因可作為高特異性siRNAs治療前列腺癌的靶向基因。

2 載體

由于腺病毒能感染體內(nèi)許多不同種類的細(xì)胞，易引起高度不良反應(yīng)，而且目標(biāo)癌細(xì)胞經(jīng)常不易被野生型腺病毒感染，因此腺病毒自身的諸多缺點(diǎn)也使以腺病毒為載體的基因治療效果大打折扣。Magnusson等［9］擬通過構(gòu)建雙靶向腺病毒載體降低非靶向不良反應(yīng)和增加對前列腺癌的靶向感染力。除了病毒再定靶于HER-2/neu基因外，再把聚氯基中的病毒RGD基序變成EGD，第三軸重復(fù)的KKTK 基序換成RKSK，產(chǎn)生載體Ad(ZH/3)。這種含ZH的載體能制成高滴度且特異于靶點(diǎn)，對雄激素依賴性Her2/neu陽性PC346C前列腺癌細(xì)胞具有有效的感染力和殺傷力。說明這種可定靶于Her2/neu的腺病毒載體可用于前列腺癌的治療，改進(jìn)了前列腺癌基因治療的載體工具。

桿狀病毒是一種昆蟲病毒，對人類沒有致病性，是一種充滿希望的基因治療載體。由于實(shí)體腫瘤生長和轉(zhuǎn)移主要依賴血管生成和hEA(human endostatin and angiostatin)，hEA是一種包括人內(nèi)皮抑素和血管抑素的混合蛋白，具有強(qiáng)大的抗血管生成和抗腫瘤作用，因此通過構(gòu)建hEA-桿狀病毒載體研究了桿狀病毒用于表達(dá)hEA癌癥基因治療的可行性。向裸鼠移植瘤內(nèi)注射病毒載體可以抑制腫瘤生長、顯著延長鼠存活時(shí)間而無不良反應(yīng)，提示桿狀病毒具有成為癌癥基因治療良好載體的潛能［10］。

非病毒載體也推動(dòng)了癌癥基因治療的發(fā)展，其中最常用的是陽離子脂質(zhì)體和納米粒子。對腫瘤而言，理想的基因治療必須是向腫瘤細(xì)胞高效率地輸送質(zhì)粒DNA (plasmid DNA，pDNA)或合成的siRNA，而且不良反應(yīng)輕或無。Hattori［11］研發(fā)了一種新型包括膽固醇-3β-對羧基氨基乙烯-N-羥基苯乙胺(cholesteryl-3betacarboxyamidoethylene-N-hydroxyethylamine，O H-C h o l)和T w e e n 8 0 的陽離子納米粒子(nanoparticle，NP)，通過向瘤體內(nèi)注射的方式測試此NP具有向前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3種植瘤高效轉(zhuǎn)染pDNA 和siRNA的作用。由于人類多種腫瘤內(nèi)過度表達(dá)葉酸受體(folate receptor，F(xiàn)R)，維生素葉酸也已被用于FR介導(dǎo)的藥物輸送，因此可用于靶向輸送。葉酸與NP結(jié)合形成了包括OHChol、Tween 80和葉酸—聚乙烯乙二醇—二硬脂酰磷脂酰乙醇胺共軛的與葉酸鏈接的納米粒子(NP-F)，經(jīng)向FR陽性鼻咽癌瘤體內(nèi)注射可明顯抑制腫瘤生長。說明以陽離子膽固醇為基礎(chǔ)的NP是治療局限性腫瘤的非病毒pDNA和siRNA載體，為下一步嘗試治療前列腺癌奠定了基礎(chǔ)。

由于目前現(xiàn)有的人工載體系統(tǒng)是單靶的，依然受有效性和特異性輸送的困擾，對應(yīng)受體類型很少，無一例外地均在靶細(xì)胞上表達(dá)。因此，Nie等［12］合成了雙受體靶向多聚復(fù)合物，模仿自然病毒的雙周期進(jìn)入細(xì)胞特征，借助雙受體內(nèi)化機(jī)制增加了載體的有效性和特異性，如在聚乙二醇化聚醚酰亞胺為基礎(chǔ)的多聚復(fù)合物的雙靶向載體系統(tǒng)里，轉(zhuǎn)鐵蛋白靶向蛋白B6和精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸多肽是兩個(gè)結(jié)合配體。通過多次兩個(gè)前列腺癌細(xì)胞株細(xì)胞分離、細(xì)胞攝取、轉(zhuǎn)染有效性和相應(yīng)競爭性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果均顯示這種載體系統(tǒng)具有較高的特異性。

3 途徑

3.1 低頻超聲放射或“sonoporation”方法

Zolochevska等［13］報(bào)道，IL-27是最近鑒定的IL-12相關(guān)性細(xì)胞介質(zhì)家族成員，具有基因治療前列腺癌的作用，能使腫瘤生長停止并介導(dǎo)腫瘤消退。為了使IL-27定靶于前列腺癌，嘗試了一種向腫瘤細(xì)胞輸送基因的新模式——低頻超聲放射或“sonoporation”的方法，利用sonoporation引導(dǎo)IL-27基因治療前列腺癌細(xì)胞，結(jié)果顯示sonoporation能增強(qiáng)前列腺癌內(nèi)效應(yīng)細(xì)胞的聚集，使IL-27表達(dá)增多，有效減緩前列腺癌生長，提示sonoporation基因治療方法策略可行。

3.2 前列腺內(nèi)注射

Sonpavde等［14］通過前列腺內(nèi)注射表達(dá)腫瘤抑制基因Glipr1的腺病毒進(jìn)行了對中、高危前列腺癌患者的一期臨床新輔助試驗(yàn)，19例患者接受了單次6 vp劑量的ADV- Glipr1注射，結(jié)果能觀察到全身免疫反應(yīng)和抗腫瘤的生物活性，不良反應(yīng)主要為尿道感染(3例)、排尿困難(1例)、流感樣綜合征(3例)和發(fā)熱(1例)。

由于跨膜蛋白claudin-3和claudin-4是產(chǎn)氣莢膜桿菌腸毒素(Clostridium perfringens enterotoxin，CPE)的靶向受體，兩者結(jié)合能激發(fā)膜孔復(fù)合物形成，引起細(xì)胞死亡，所以Walther等［15］通過前列腺內(nèi)注射野生型CPE cDNA 或優(yōu)化型CPE cDNA基因，治療過表達(dá)claudin-3和-4的前列腺癌。結(jié)果顯示，基因注射72 h后不良反應(yīng)達(dá)100%；與野生型CPE cDNA相比，優(yōu)化型CPE cDNA不良反應(yīng)產(chǎn)生快速但效果更強(qiáng)。

Kawauchi等［16］使用腺病毒-人腫瘤抑制基因REIC/Dkk-3(adenoviral vectors -human tumor suppressor gene REIC/Dkk-3，Ad-hREIC)行鼠前列腺內(nèi)注射，與對照組相比可觀察到AdhREIC的凋亡和抗腫瘤效果，認(rèn)為腺病毒介導(dǎo)的REIC/Dkk-3行原位注射基因治療對于前列腺癌的臨床治療是有用的。當(dāng)局部注射低劑量Ad-REIC時(shí)，發(fā)現(xiàn)介質(zhì)生物分布到前列腺、膀胱和結(jié)腸；當(dāng)注射大劑量時(shí)介質(zhì)分布得更遠(yuǎn)，可到肺、胸腺、心、肝和腎上腺；而且只有當(dāng)注射大劑量時(shí)，才能在前列腺內(nèi)觀察到急性炎癥反應(yīng)而其他組織無異常［17］。因此推測，通過前列腺內(nèi)注射而實(shí)施的腺病毒介導(dǎo)的原位REIC/Dkk-3基因治療對于治療人前列腺癌是安全的；結(jié)合上述3組試驗(yàn)結(jié)果可以得出，通過前列腺內(nèi)注射途徑進(jìn)行基因治療可行性強(qiáng)的初步結(jié)論。

4 方案

4.1 靶向基因治療與內(nèi)放療聯(lián)合

Barton等［18］研發(fā)了具有復(fù)制作用的配備兩個(gè)自殺式基因和人碘化鈉轉(zhuǎn)運(yùn)體(human sodium iodide symporter，hNIS)基因的腺病毒Ad5-yCD/mutTK(SR39)rep-hNIS。其中hNIS是與細(xì)胞核結(jié)合的示蹤基因，當(dāng)它與放射性131I結(jié)合時(shí)發(fā)揮部分治療作用。在經(jīng)直腸超聲引導(dǎo)下，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的注射模式向6例患者的前列腺內(nèi)注射5 mL的Ad5-yCD/mutTK(SR39)rep-hNIS，分成12個(gè)注射點(diǎn)，通過單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層成像技術(shù)檢測前列腺中hNIS基因的表達(dá)。結(jié)果顯示，6例患者的前列腺內(nèi)hNIS基因的表達(dá)率為100%，平均每個(gè)前列腺體積的45%覆蓋著表達(dá)基因。這種組合體為下一步前列腺癌的對照研究提供了條件。

4.2 靶向基因治療與免疫治療聯(lián)合

鼠和人的基因Glipr1和GLIPR1/RTVP-1在許多癌細(xì)胞系(包括前列腺癌)中作為具有凋亡前活性的p53直接靶點(diǎn)。裸鼠原位和轉(zhuǎn)移前列腺癌瘤內(nèi)注射轉(zhuǎn)導(dǎo)和表達(dá)Glipr1的腺病毒載體AdGlipr1，均可產(chǎn)生明顯的治療效果。與空白對照組相比，AdGlipr1轉(zhuǎn)導(dǎo)的巨噬細(xì)胞表面積增大、CD40、CD80和MHCⅡ分子表達(dá)增多、合成更多的IL-12和IL-6。向瘤體內(nèi)注射AdGlipr1轉(zhuǎn)導(dǎo)的巨噬細(xì)胞能顯著抑制前列腺腫瘤生長和肺轉(zhuǎn)移，延長存活期。這些數(shù)據(jù)提示瘤體內(nèi)注射的AdGlipr1轉(zhuǎn)導(dǎo)的巨噬細(xì)胞能順淋巴結(jié)的引流方向移動(dòng)，誘導(dǎo)全身自然殺傷細(xì)胞的活性和腫瘤特異性細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞應(yīng)答的產(chǎn)生［19］。另外，TRAIL慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)淋巴細(xì)胞后形成的TRAIL-淋巴細(xì)胞增強(qiáng)了細(xì)胞毒效應(yīng)，血液輸注TRAIL-淋巴細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞或腫瘤周圍注射TRAIL-淋巴細(xì)胞能減緩前列腺癌生長甚至凋亡，TRAIL-淋巴細(xì)胞聯(lián)合雙重特異性抗體EpCAMxCD3能增強(qiáng)抗凋亡和抗增殖信號和減少腫瘤血管形成而加速腫瘤消除［20］。因此，這種新型的方法能通過誘導(dǎo)抗腫瘤免疫應(yīng)答發(fā)揮更有效的治療作用，提示這種基因-免疫聯(lián)合治療可能是支持體內(nèi)免疫反應(yīng)、治療進(jìn)展期前列腺癌的新方法。

4.3 靶向基因治療與化療聯(lián)合

在體外實(shí)驗(yàn)中，在pIRES質(zhì)粒中構(gòu)建由PSMA啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的雙自殺式基因聯(lián)合5-氟胞嘧啶和巨細(xì)胞病毒，用于前列腺癌細(xì)胞株的體外治療實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)可高度抑制前列腺癌生長；進(jìn)而體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中可觀察到去勢裸鼠內(nèi)種植瘤生長延緩和轉(zhuǎn)移灶消亡，顯示特異性雙自殺式基因與化療聯(lián)合的策略是治療前列腺癌的潛在選擇［21］。

4.4 靶向基因治療與抗病毒藥物聯(lián)合

Terao等［22］研究了激素抵抗前列腺癌患者接受了單純皰疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶(osteocalcin promoter-driven herpes simplex virus thymidine kinase，Ad-OC-TK)聯(lián)合伐昔洛韋(valacyclovir，VAL)治療對生活質(zhì)量影響程度的問卷調(diào)查。6例患者分別在第0、14、28天填寫了歐洲癌癥研究和治療組織的前列腺癌專用生活質(zhì)量調(diào)查表。結(jié)果顯示所有項(xiàng)目評分及總評分均顯著改善，病毒的不良反應(yīng)不明顯；同時(shí)揭示了前列腺特異性抗原水平與身體疼痛改變顯著相關(guān)。調(diào)查結(jié)果說明了Ad-OC-TK聯(lián)合VAL能顯著改善患者短期生活質(zhì)量和因局部復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移灶引起的疼痛。

5 結(jié)語

盡管前列腺癌靶向基因治療在上述4個(gè)方面的研究成果顯著，但是如下情況仍沒有徹底扭轉(zhuǎn)：作為最常用基因載體的腺病毒在人體內(nèi)的使用、特別是靜脈內(nèi)注射的安全性和條件性復(fù)制的可實(shí)用性受到限制，腺病毒對靶細(xì)胞的有限感染性和進(jìn)入病灶前不可避免地要經(jīng)受肝臟和免疫系統(tǒng)不同程度的清除。因此，對CRPC靶向基因治療的研究仍任重道遠(yuǎn)，達(dá)到一線治療目標(biāo)仍沒有明確的時(shí)間表；不過靶向基因治療依然是最具潛力、最具希望的CRPC治療方法，其缺點(diǎn)可通過嘗試多次定靶、新型靶向輸送方法(如超聲)、聯(lián)合分子靶向治療等方式逐步解決。

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