PTZ誘導(dǎo)孕鼠癇性發(fā)作對胎鼠海馬中bax、bcl-2、capase-3 表達(dá)的影響

曲珍珍， 王維平， 毛卓鋒， 欒紹群， 謝 濤， 袁淑珍

癲癇是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，可導(dǎo)致多種功能損傷，其中包括生理機(jī)能、精神心理、社會功能等。據(jù)估計0.5%的懷孕婦女患有癲癇，大多數(shù)癲癇婦女的子代發(fā)育正常，但仍有2% ～6%的孩子可能出現(xiàn)發(fā)育遲緩［1］，并且出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙的機(jī)率是正常母親所生孩子的2～7倍［2］。Adab N的研究顯示母親孕期全身強(qiáng)直陣攣發(fā)作，其孩子的IQ得分明顯降低［3］。細(xì)胞凋亡也稱細(xì)胞程序性死亡，伴隨著細(xì)胞的繁殖、分化在胚胎器官的正常發(fā)育中起重要作用。在正常胚胎器官形成時期，存在由bcl-2蛋白家族調(diào)節(jié)的細(xì)胞凋亡，促凋亡蛋白bax和抑凋亡蛋白bcl-2的比值決定了胚胎細(xì)胞凋亡的數(shù)目［4］。另外，caspase-3是凋亡效應(yīng)蛋白之一，在胚胎組織的發(fā)育和病理性細(xì)胞死亡中有重要作用［5］。海馬在學(xué)習(xí)和記憶等認(rèn)知功能中有重要作用，對于應(yīng)激和其他有害的外源性刺激較其他腦區(qū)域更易受損傷。本實驗采用戊四氮誘導(dǎo)癲癇模型，觀察胎鼠海馬中bcl-2、bax及caspase-3的變化，以探討癇性發(fā)作對胎鼠影響的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物分組及模型制備 雌性SD大鼠15只，河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，體重200±20g，SPF級。將大鼠隨機(jī)分為正常對照組(NC)10只、鹽水組(NS)10只、癲癇組(PTZ)15只。癲癇組每天腹腔注射1%PTZ(Sigma公司)35mg/kg;鹽水組給予等劑量的生理鹽水;對照組不做任何處理，注射完畢后各組大鼠每天觀察1h。按照Racine［6］分級標(biāo)準(zhǔn)連續(xù)3次獲得Ⅳ級或Ⅳ級以上的運動性驚厥大鼠為完全點燃。連續(xù)給藥30d，癲癇組隨機(jī)抽取點燃成功的大鼠10只，將3組雌性SD大鼠與雄性SD大鼠于晚8點合籠，次日早晨觀察陰栓，有陰栓者記為孕0d，各組孕鼠繼續(xù)孕前處理至孕20d。

1.2 Western blot檢測 bax、bcl-2 及 caspase-3蛋白水平 孕鼠懷孕第20天，將各組孕鼠腹腔麻醉后，剖腹取胎鼠，快速分離海馬，提取總蛋白，測蛋白濃度，取50μg蛋白95℃ ～98℃變性5min，以非連續(xù)Tris-SDS聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳，電轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上。脫脂奶粉室溫封閉 1h，兔抗大鼠caspase-3多抗隆抗體(1∶400，巴傲德公司)、bax多抗隆抗體(1∶200，巴傲德公司)及bcl-2多抗隆抗體(1∶400，巴傲德公司)4℃過夜，漂洗5次，山羊抗兔IgG熒光抗體(1∶10000，Rocland公司)室溫避光1h，漂洗5次，遠(yuǎn)紅外熒光掃描成像系統(tǒng)(Odyssey公司)掃描并測定目標(biāo)蛋白單位光密度值，與GAPDH(1∶500，中杉金橋)比值后，做統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)結(jié)果 PTZ組大鼠腹腔注射6～8d后出現(xiàn)凝視、點頭、反復(fù)洗臉等動作，癥狀逐漸加重，最終出現(xiàn)全身強(qiáng)直陣攣發(fā)作。PTZ組大鼠懷孕后繼續(xù)給予35mg/kg的戊四氮，觀察到孕鼠癲癇發(fā)作程度減輕，癲癇抽搐持續(xù)時間縮短。

2.2 胎鼠海馬組織 caspase-3、bax及 bcl-2蛋白表達(dá) 與NS組和NC組比較，PTZ組胎鼠海馬組caspase-3、bax蛋白表達(dá)明顯增加，bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低(P ＜0.05)(見表1)。

表1 caspases-3、bax及bcl-2蛋白在3組胎鼠海馬組織中的表達(dá)(±s)

表1 caspases-3、bax及bcl-2蛋白在3組胎鼠海馬組織中的表達(dá)(±s)

PTZ組與NC組及NS組比較*P＜0.05;NS組與NC組比較#P＞0.05

組別 例數(shù)caspase/gapdh bax/gapdh Bcl-2/gapdh PTZ NS NC 666 2.57 ±0.08*0.60 ±0.17#0.53 ±0.13 3.24 ±0.32*1.76 ±0.17#1.55 ±0.11 1.42 ±0.074*2.36 ±0.10#2.45 ±0.07

3 討論

本實驗采用戊四氮誘導(dǎo)大鼠慢性癲癇模型，觀察孕期母鼠的癇性發(fā)作對子代發(fā)育的影響，避免了臨床上因應(yīng)用抗癲癇藥物而無法區(qū)分是癇性發(fā)作本身還是抗癲癇藥物對子代發(fā)育造成的不利影響。大量的實驗已證明，抗癲癇藥物能增加子代畸形的發(fā)生，而孕期癇性發(fā)作對子代發(fā)育有無影響的研究尚未見明確報道。本實驗采用腹腔注射生理鹽水作為假手術(shù)組，排除腹腔給藥針刺腹部對孕鼠造成的應(yīng)激反應(yīng)對胚胎的影響。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)存在正常的凋亡現(xiàn)象，貫穿于胚胎形成到衰老的整個過程中［7］。在細(xì)胞凋亡過程中，bcl-2家族和caspases家族起著重要作用，中樞神經(jīng)系統(tǒng)局部缺血和感染導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)均與細(xì)胞凋亡有關(guān)。bcl-2家族大約由15個成員組成，根據(jù)其結(jié)構(gòu)和功能的不同，可分為3個亞家族:(1)bcl-2亞家族，成員有bcl-2、bcl-xl、bcl-w 和 mcl-1等，主要抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生;(2)bax亞家族，成員有bax、bak及bok，主要促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生;(3)bcl-2同源結(jié)構(gòu)域-BH3亞家族，成員有bik、blk、bad和bid等，主要促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

凋亡刺激信號激活bcl-2蛋白家族中促凋亡蛋白bax、bak和bid，誘導(dǎo)線粒體中的細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞質(zhì)，激活內(nèi)源性細(xì)胞凋亡通路，細(xì)胞色素C同細(xì)胞質(zhì)中凋亡蛋白酶激活因子(Apaf-1)結(jié)合，然后同caspase-9前體形成凋亡小體，在凋亡小體中caspase9前體被激活，活化的caspase-9激活caspase-3和7，通過分解細(xì)胞內(nèi)蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

bcl-2(又稱B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2)，是從小鼠細(xì)胞淋巴瘤中分離出的一種原癌基因，表達(dá)產(chǎn)物是bcl-2 蛋白，分子量為 25kDa［8］，主要位于核膜上，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體膜上也有分布，通過抑制線粒體膜上轉(zhuǎn)變孔的開放而調(diào)節(jié)其通透性，從而抑制細(xì)胞色素C及其他促凋亡蛋白釋放到線粒體膜外，不能激活caspase，最終抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。在凋亡級聯(lián)反應(yīng)中bcl-2蛋白的下游是caspase(半胱天冬酶)［9］。

caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，被稱為死亡蛋白酶，其中C代表它具有半胱氨酸(cysteine)蛋白酶活性，aspase代表它具有在天冬氨酸(aspartic-acid)之后切割蛋白的能力。caspase全稱為天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白水解酶。它們以不活躍的形式(pro-caspase)或酶原的形式存在細(xì)胞中。它們的活性位點均含有半胱氨酸殘基，能夠特異性的切割靶蛋白天冬氨酸殘基后的肽鍵。酶原的氨基端有一段被稱為“原結(jié)構(gòu)域”(pro-domain)的序列，酶原活化時將原結(jié)構(gòu)域切除，同時分成小片段(12kDa)和(17kDa)兩個亞型才能有效。其表達(dá)上調(diào)表明凋亡通路被激活，細(xì)胞死亡增加。海馬神經(jīng)元的形成對于學(xué)習(xí)和記憶很重要［10］。海馬形成的幾個亞區(qū)CA1和CA3包括豐富的錐體細(xì)胞，DG區(qū)由幾層小顆粒細(xì)胞組成［11］。小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元在孕第15～16天形成;CA3神經(jīng)元在孕14～15d形成［12］。DG區(qū)顆粒細(xì)胞層在孕 20d時開始形成［13］，新生兒期小鼠缺血缺氧所導(dǎo)致的神經(jīng)元死亡多發(fā)生在海馬的CA1和CA3區(qū)，同時在顆粒細(xì)胞層和齒狀門處也可見到。馬金龍［14］在高溫致神經(jīng)管畸形的研究中發(fā)現(xiàn)高溫能干擾bcl-2和bax的表達(dá)，誘發(fā)神經(jīng)上皮的凋亡，導(dǎo)致神經(jīng)管畸形的發(fā)生。王瑩［15］等的研究表明，孕鼠注射海洛因后可引起子代小鼠海馬caspase-3和bax表達(dá)上調(diào)，bcl-2表達(dá)下調(diào)，線粒體凋亡通路可能參與了海洛因損傷小鼠神經(jīng)行為發(fā)育的分子機(jī)制。Nasiraei-Moghadam S［16］等在孕鼠暴露于嗎啡的研究中顯示在胚胎發(fā)育的第一時期給予嗎啡干預(yù)，通過上調(diào)bax/bcl-2蛋白的比值及其下游caspase-3的活化而增加神經(jīng)細(xì)胞凋亡的敏感性。

本研究中觀察到大鼠懷孕后其癇性發(fā)作的程度降低，可能是孕激素能夠抑制癇性發(fā)作。Western blot結(jié)果顯示，癲癇組子代海馬神經(jīng)元中caspase-3蛋白、bax蛋白表達(dá)較空白對照組及假手術(shù)組增加;而bcl-2蛋白較空白對照組及假手術(shù)組降低，caspase-3、bax及bcl-2蛋白在空白對照組及假手術(shù)組中表達(dá)無差異，說明孕期每日腹腔刺激孕鼠對胚胎沒有影響。孕期癇性發(fā)作后由于缺氧或酸中毒等刺激及孕期抽搐后孕鼠體內(nèi)的激素水平發(fā)生變化，均可能激活子代海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡程序，使海馬神經(jīng)元凋亡增加。以上結(jié)果說明癲癇組孕期癇性發(fā)作可能影響子代海馬神經(jīng)元發(fā)育以及使子代海馬神經(jīng)元凋亡增加。

綜上所述，孕期癇性發(fā)作使子鼠海馬促凋亡蛋白bax表達(dá)增加，抑凋亡蛋白bcl-2表達(dá)降低，凋亡執(zhí)行蛋白caspase-3表達(dá)增加。推測孕期癇性發(fā)作能使海馬神經(jīng)元凋亡增加，從而導(dǎo)致海馬的形態(tài)結(jié)構(gòu)異常，進(jìn)而可能影響子代的學(xué)習(xí)記憶功能。

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