載脂蛋白E擬肽對(duì)EAE小鼠的髓鞘和軸突損傷的影響

韋俊杰， 鄭明華， 梁培霄， 陶 敏， 唐玉蘭

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)是一種累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)的以髓鞘脫失為主伴軸突損傷為病理特征的自身免疫性疾病。缺乏ApoE會(huì)加重MS動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)的疾病進(jìn)展和病理損傷［1］。ApoE擬肽是一種體外合成的小分子肽，保留了結(jié)合ApoE受體的主要結(jié)構(gòu)域(133-149)，通過外周給藥能穿過血腦屏障，模擬ApoE發(fā)揮生物學(xué)作用［2］。而ApoE擬肽治療對(duì)EAE的MBP和NF-L的影響，國(guó)內(nèi)外未見相關(guān)報(bào)道。

本研究通過對(duì)EAE小鼠進(jìn)行ApoE擬肽干預(yù)，觀察其臨床癥狀和病理變化，并用免疫組化法檢測(cè)MBP和NF-L的表達(dá)，研究ApoE擬肽對(duì)EAE的作用效果，探索多發(fā)性硬化治療的新方法。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物和試劑 8～10w清潔級(jí)雌性的C57BL/6J小鼠40只，體重18～22g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司［動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(京)2009-0004］。COG112(序列 acetyl-YRQIKIWFQNRRMKWKKCLRVRLASHLRKLRKRLL-amide)由美國(guó) Cognosci公司提供，純度 ＞95%。MOG35-55(序列MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK)由上海生工生物工程有限公司合成，純度＞95%。百日咳毒素購自美國(guó)sigma公司;完全弗氏佐劑(CFA)購自加拿大bio basic公司;卡介苗購自北京生物制品研究所;兔抗MBP多克隆一抗、兔抗NF-L多克隆一抗均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司;SP法免疫組化試劑盒、DAB顯色盒均購自北京中杉金橋有限公司。

1.2 方法

1.2.1 制模及干預(yù) 用0.01mol/L PBS緩沖液將少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(MOG35-55)稀釋成2mg/ml，與等量的含6mg/ml卡介苗的CFA充分混合，用全玻璃注射器抽打制成油包水乳劑抗原。隨機(jī)將C57BL/6J小鼠分為正常組(n=10)、正常治療組(n=10)、EAE 組(n=10)、EAE 治療組(n=10)。EAE組、EAE治療組于小鼠背部皮下多點(diǎn)注射MOG35-55乳劑抗原0.2ml/只。正常組、正常治療組用生理鹽水代替MOG35-55，余步驟和方法同前。免疫當(dāng)天計(jì)為第0天，分別于第0、2天給每只小鼠腹腔注射百日咳毒素0.5μg/次。正常治療組、EAE治療組在免疫后第2天到第30天每隔兩天按5mg/kg/day背部皮下注射COG112。正常組和EAE組除了用生理鹽水替代COG112外，余給藥方法相同。

1.2.2 癥狀及功能評(píng)分 免疫后第0～35天每日上午由同一個(gè)人觀察小鼠癥狀并進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，同時(shí)測(cè)量體重并記錄。神經(jīng)功能評(píng)分采用15分評(píng)分法［3］。尾巴:0分為不發(fā)病;1分為尾巴張力減低;2分為尾巴全癱。四肢按每個(gè)肢體單獨(dú)評(píng)估:0分為無癥狀;1分為步態(tài)不穩(wěn);2分為肢體輕癱;3分為肢體全癱。將尾巴和每個(gè)肢體所得分?jǐn)?shù)再累加得出總分，小鼠尾巴及四肢全癱達(dá)到14分，出現(xiàn)死亡則評(píng)15分。

1.2.3 解剖及病理染色 免疫后第35天以10%的水合氯醛按體質(zhì)量3m l/kg腹腔注射麻醉小鼠，先后經(jīng)左心室灌注生理鹽水和4%多聚甲醛，解剖分離大腦、腦干和脊髓，浸泡在4%多聚甲醛中4℃固定24h，然后逐級(jí)酒精脫水、石蠟包埋、切片、行HE染色。

1.2.4 免疫組化 將包埋好的石蠟組織塊做4μm連續(xù)切片，余下按SP法免疫組化試劑盒說明書操作。陽性表達(dá)為細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)染成黃色或棕黃色，陰性對(duì)照用PBS代替一抗，余步驟相同。每只小鼠的大腦、腦干和脊髓各取3張切片，每張切片在顯微鏡下選取互不重復(fù)的5個(gè)視野(×400倍)，采用Image-proplus6.0軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析，測(cè)定每個(gè)視野的積分光密度值(IOD)和陽性面積(area)，計(jì)算平均積分光密度(IOD/area)。

2 結(jié)果

2.1 發(fā)病情況 EAE組、EAE治療組的小鼠全部發(fā)病，但各有1只小鼠發(fā)病后死亡。兩組小鼠均在免疫第10天后開始陸續(xù)發(fā)病，癥狀隨時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸加重，高峰期后有一定的緩解。兩組比較潛伏期、峰值評(píng)分均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，而慢性期(第35天)評(píng)分、累積臨床評(píng)分EAE治療組均優(yōu)于EAE組(P＜0.05)(見表1)。

2.2 HE染色結(jié)果 EAE小鼠大腦、腦干和脊髓均有不同程度的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，部分小血管周圍的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)呈袖套樣改變。EAE治療組小鼠炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯輕于EAE組，浸潤(rùn)以腦干和脊髓為明顯，大腦較少見。正常組和正常治療組均未見異常(見圖1)。

2.3 各組MBP的表達(dá)比較 通過免疫組化測(cè)定各組織MBP的平均積分光密度發(fā)現(xiàn)，正常組和正常治療組相比無明顯差異(P＞0.05)，EAE組的大腦、中腦和EAE治療組的各部位均低于正常組和正常治療組(P＜0.05)，EAE治療組的中腦和脊髓均高于 EAE 組(P ＜0.05)(見表2、圖2)。

2.4 各組NF-L的表達(dá)比較 通過免疫組化測(cè)定各組織NF-L的平均積分光密度發(fā)現(xiàn)，正常組和正常治療組相比無明顯差異(P＞0.05)，而EAE組的大腦、脊髓和EAE治療組的各部位均低于正常組和正常治療組(P＜0.05)，EAE治療組的中腦和脊髓均高于EAE組(P＜0.05)(見表3、圖3)。

表1 臨床癥狀觀察(±s)

表1 臨床癥狀觀察(±s)

與EAE組比較*P＜0.05

組別 潛伏期(d)峰值評(píng)分 慢性期評(píng)分 累積臨床評(píng)分EAE組EAE治療組13.20 ±2.04 13.40 ±2.68 7.80 ±3.49 4.90 ±3.96 4.33 ±2.29 1.67 ±1.11*97.89 ±36.81 56.33 ±37.83*

表2 MBP在實(shí)驗(yàn)小鼠CNS中的表達(dá)(±s)

表2 MBP在實(shí)驗(yàn)小鼠CNS中的表達(dá)(±s)

與EAE組比較*P＜0.05;與正常組比較#P＜0.05;與正常治療組比較△P＜0.05

組別平均光密度值大腦 中腦 脊髓EAE組EAE治療組正常組正常治療組0.1060 ±0.0119#△0.1199 ±0.0102#△0.1514 ±0.0189 0.1459 ±0.0286 0.0949 ±0.0221#△0.1214 ±0.0161*#△0.1455 ±0.0311 0.1543 ±0.0299 0.1011 ±0.0155#△0.1207 ±0.0201*0.1362 ±0.0324 0.1480 ±0.0139

表3 NF-L在實(shí)驗(yàn)小鼠CNS中的表達(dá)(±s)

表3 NF-L在實(shí)驗(yàn)小鼠CNS中的表達(dá)(±s)

與EAE組比較*P＜0.05;與正常組比較#P＜0.05;與正常治療組比較△P＜0.05

組別平均光密度值大腦 中腦 脊髓EAE組EAE治療組正常組正常治療組0.1381 ±0.0221#△0.1419 ±0.0205#△0.1755 ±0.0364 0.1822 ±0.0434 0.1389 ±0.0293#△0.1562 ±0.0255*0.1625 ±0.0397 0.1645 ±0.0230 0.1400 ±0.0197#△0.1605 ±0.0467*#△0.1768 ±0.0374 0.1765 ±0.0455

3 討論

在CNS內(nèi)，神經(jīng)軸突生長(zhǎng)和髓鞘合成所必需的脂質(zhì)主要依靠ApoE來轉(zhuǎn)運(yùn)。此外ApoE還能發(fā)揮清除代謝產(chǎn)物、維護(hù)血腦屏障、減少毒性損傷、調(diào)節(jié)免疫功能等作用。但完整的ApoE分子量大，正常狀態(tài)下不能通過血腦屏障，限制了其作為外源性藥物的應(yīng)用。COG112作為一種近年來研制出的ApoE擬肽，在保留結(jié)合ApoE受體的主要結(jié)構(gòu)域(133-149)的同時(shí)還融合了果蠅觸角蛋白的轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)域，更容易通過血腦屏障發(fā)揮作用［4］。

本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，EAE組的慢性期評(píng)分、累積臨床評(píng)分均高于EAE治療組，說明 COG112的干預(yù)可減緩EAE病情進(jìn)展。雖然EAE組的峰值評(píng)分高于EAE治療組，但是P=0.099沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能是由于兩組均有一只小鼠因死亡評(píng)了15分，計(jì)入該評(píng)分導(dǎo)致兩組該統(tǒng)計(jì)學(xué)差距的縮短。如果兩組峰值評(píng)分均不納入死亡小鼠，則峰值評(píng)分差異(7.00±2.55 對(duì)3.78 ±1.86，P=0.007 ＜0.05) 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

本實(shí)驗(yàn)將MOG35-55制成乳化抗原免疫C57BL/6J小鼠成功誘發(fā)了EAE模型，該模型具有病程慢性進(jìn)展、炎性反應(yīng)輕、脫髓鞘和軸突損傷明顯等特點(diǎn)［5］，適用于研究藥物對(duì)EAE髓鞘脫失和軸突損傷的影響。MBP作為CNS髓鞘的主要蛋白質(zhì)，是反應(yīng)髓鞘脫失情況的高特異性的指標(biāo)。作為神經(jīng)絲成分之一的NF-L被認(rèn)為是MS患者腦脊液中特異性較高的軸突損傷指標(biāo)［6］。EAE治療組的 MBP和NF-L的表達(dá)比EAE組有所提高，說明COG112的干預(yù)能減輕EAE的髓鞘脫失和軸突損傷。在本實(shí)驗(yàn)中EAE治療組的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較EAE組減少，與國(guó)際上報(bào)道COG112能改善EAE的病情并減少淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)的研究結(jié)果［4］相符合，但該報(bào)道中未用到免疫組化檢測(cè)MBP和NF-L來觀察髓鞘脫失和軸突損傷情況，而本實(shí)驗(yàn)正好完善了該方面的研究。

目前認(rèn)為COG112通過以下機(jī)制發(fā)揮對(duì)EAE的保護(hù)作用:一個(gè)方面，COG112能促進(jìn)損傷的髓鞘和軸突的修復(fù)。COG112保留有ApoE的受體結(jié)合域，該結(jié)合域能結(jié)合低密度脂蛋白受體(LDLR)和LDLR相關(guān)蛋白1(LRP1)［7］，結(jié)合少突膠質(zhì)細(xì)胞的 LRP1能使鞘磷脂更容易被細(xì)胞攝?。?］，結(jié)合神經(jīng)元的LRP1能抑制神經(jīng)元的凋亡［9］。另一個(gè)方面，COG112能減少損傷髓鞘和軸突的不利因素。首先，COG112的結(jié)合域能抑制小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的激活，阻止其炎性信號(hào)的傳導(dǎo)，并減少其TNF-α、IL-6的分泌［10，11］。其次，在動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn) COG112能抑制CD4+T淋巴細(xì)胞的增殖，同時(shí)還降低巨噬細(xì)胞的TNF-α、IL-6、一氧化氮(NO)、NO 合成酶的表達(dá)［4］。再者，COG112結(jié)合域能部分性競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)的受體［12］，NMDA 受體是與神經(jīng)毒性氨基酸如谷氨酸等結(jié)合的受體之一。而EAE中已激活的免疫細(xì)胞會(huì)釋放大量的谷氨酸，高濃度的谷氨酸能直接對(duì)神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生興奮毒性，導(dǎo)致細(xì)胞損傷和凋亡。COG112能通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合NMDA受體從而發(fā)揮拮抗谷氨酸的神經(jīng)毒性作用，在EAE的神經(jīng)毒性損傷中起到神經(jīng)保護(hù)作用。

本研究發(fā)現(xiàn)COG112能改善EAE模型的臨床癥狀，減輕髓鞘和軸突的損傷，促進(jìn)髓鞘修復(fù)和軸突的再生，對(duì)EAE起到了治療作用，可能為MS臨床治療提供新的方法。但由于MS對(duì)髓鞘和軸突的損傷機(jī)制復(fù)雜，還需要與淋巴細(xì)胞和炎性因子的變化結(jié)合起來研究EAE模型中ApoE擬肽的作用機(jī)制，并根據(jù)研究成果來改進(jìn)ApoE擬肽的用法，以期達(dá)到最優(yōu)療效。

圖1 A:EAE組;B:EAE治療組;C:正常組;D:正常治療組(HE染色，×400)

圖2 E:EAE組;F:EAE治療組;G:正常組;H:正常治療組(MBP免疫組化染色，×400)

圖3 I:EAE組;J:EAE治療組;K:正常組;L:正常治療組(NF-L免疫組化染色，×400)

［1］Karussis D，Michaelson DM，Grigoriadis N，etal.Lack of apolipoprotein-E exacerbates experimental allergic encephalomyelitis［J］.Mult Scler，2003，9(5):476-480.

［2］Laskowitz DT，F(xiàn)illit H，Yeung N，etal.Apolipoprotein E-derived peptides reduce CNS inflammation:implications for therapy of neurological disease［J］.Acta Neurol Scand Suppl，2006，114(suppl 185):15-20.

［3］Weaver A，Goncalves Da Silva A，Nuttall RK，etal.An elevatedmatrix metalloproteinase(MMP)in an animalmodel ofmultiple sclerosis is protective by affecting Th1/Th2 polarization［J］.FASEB J，2005，19(12):1668-1670.

［4］Li FQ，Sempowski GD，McKenna SE，etal.Apolipoprotein E-derived peptides ameliorate clinical disability and inflammatory infiltrates into the spinal cord in amurinemodel ofmultiple sclerosis［J］.JPharmacol Exp Ther，2006，318(3):956-965.

［5］Gold R，Linington C，Lassmann H.Understanding pathogenesis and therapy ofmultiple sclerosis viaanimalmodels:70 yearsofmeritsand culprits in experimental autoimmune encephalomyelitis research［J］.Brain，2006，129(8):1953-1971.

［6］Teunissen CE，Dijkstra C，Polman C.Biologicalmarkers in CSF and blood for axonal degeneration inmultiple sclerosis［J］.Lancet Neurol，2005，4(1):32-41.

［7］Croy JE，Brandon T，Komives EA.Two apolipoprotein E mimetic peptides，ApoE(130-149)and ApoE(141-155)2，bind to LRP1［J］.Biochemistry，2004，43(23):7328-7335.

［8］Gaultier A，Wu X，Le Moan N，etal.Low-density lipoprotein receptorrelated protein 1 is an essential receptor formyelin phagocytosis［J］.J Cell Sci，2009，122(8):1155-1162.

［9］Hayashi H，Campenot RB，Vance DE，etal.Apolipoprotein E-containing lipoproteins protect neurons from apoptosis via a signaling pathway involving low-density lipoprotein receptor-related protein-1［J］.J Neurosci，2007，27(8):1933-1941.

［10］Lynch JR，TangW，Wang H，etal.APOE genotype and an ApoE-mimetic peptidemodify the systemic and central nervous system inflammatory response［J］.JBiol chem，2003，278(49):48529-48533.

［11］Christensen DJ，Ohkubo N，Oddo J，etal.Apolipoprotein E and peptidemimeticsmodulate inflammation by binding the SET protein and activating protein phosphatase 2A［J］.J Immunol，2011，186(4):2535-2542.

［12］Sheng Z，Prorok M，Brown BE，etal.N-Methyl-D-aspartate receptor inhibition by an apolipoprotein E-derived peptide relies on low-density lipoprotein receptor-associated protein［J］.Neuropharmacology，2008，55(2):204-214.