重組腺病毒介導(dǎo)的血管生長(zhǎng)素基因轉(zhuǎn)染對(duì)大鼠局灶性腦缺血的治療作用

唐春花 郭淮蓮， 唐文雄， 張偉赫

腦缺血后腦內(nèi)血管生成情況與神經(jīng)功能恢復(fù)有著密切的相關(guān)性。Krupinski等［1］研究發(fā)現(xiàn)腦梗死患者缺血腦區(qū)微血管密度顯著增加，梗死區(qū)域新生血管數(shù)目越多則患者存活時(shí)間越長(zhǎng)。治療性血管生成的概念日益受到重視，通過重組腺病毒方式將促血管生成的基因轉(zhuǎn)染到腦組織從而刺激和誘導(dǎo)血管增生成為目前治療缺血性腦血管病的研究熱點(diǎn)，為治療缺血性腦血管病開辟了一條全新的思路［2］。血管生長(zhǎng)素(angiogenin，ANG)是一種有效的促血管生長(zhǎng)因子，具有很強(qiáng)的誘導(dǎo)新生血管生成和生長(zhǎng)的作用［3］。研究已經(jīng)證實(shí)，外源性給予ANG能刺激缺血區(qū)側(cè)支循環(huán)形成和增加局部血流，減少細(xì)胞凋亡，明顯改善動(dòng)物肢體缺血［4］和心肌缺血［5］。ANG 對(duì)缺血腦組織的作用目前報(bào)道尚少。本研究利用大鼠腦缺血再灌注模型，采用側(cè)腦室內(nèi)注射方式轉(zhuǎn)染Ad-ANG，探討ANG基因轉(zhuǎn)染對(duì)大鼠損傷腦組織的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 雄性SD大鼠32只，體重280～330g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分成重組血管生長(zhǎng)素腺病毒治療組(Ad-ANG治療組，含綠色熒光蛋白基因)和重組綠色熒光蛋白腺病毒處理組(Ad-GFP對(duì)照組)，每組16只。兩組均在大腦中動(dòng)脈阻塞再灌注術(shù)后24h經(jīng)側(cè)腦室注射相應(yīng)的重組腺病毒。

1.2 藥品、試劑及儀器 重組血管生長(zhǎng)素腺病毒(Ad-ANG，含GFP基因)及重組綠色熒光蛋白腺病毒 Ad-GFP(Biosea)，2.5X1011pfu/ml。兔抗大鼠ANG多克隆抗體(Santa Cruz)，兔抗大鼠vWF多克隆抗體(Abcom)，二步法免疫組織化學(xué)試劑盒(北京中山金橋生物技術(shù)公司)，TUNEL試劑盒(R＆D)。儀器:Leica DM RXA顯微鏡(德國(guó))。

1.3 大鼠線栓法腦缺血再灌注模型［6］及側(cè)腦室注射［7］大鼠10%水合氯醛(0.35g/kg)腹腔麻醉后取仰臥位，做頸部前正中切口，分離暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈及翼腭動(dòng)脈，用微動(dòng)脈夾暫時(shí)夾閉頸總動(dòng)脈，結(jié)扎翼腭動(dòng)脈，并在頸外動(dòng)脈近心端、遠(yuǎn)心端分別穿線，遠(yuǎn)心端系緊，近心端系一個(gè)松結(jié)(備用)，在頸外動(dòng)脈的兩線間剪一個(gè)小口，將預(yù)先制備好的線栓，經(jīng)小口插入頸外動(dòng)脈并送入頸內(nèi)動(dòng)脈，插入深度(距頸總動(dòng)脈分叉處)為(18.5±1.5)mm。外留1cm長(zhǎng)尼龍線，縫合皮膚。栓塞90min后拔除尼龍線，此時(shí)血流再通，制成腦缺血再灌注模型。動(dòng)物蘇醒后表現(xiàn)為提尾時(shí)右側(cè)前肢內(nèi)收屈曲;同側(cè) Horner征;爬行時(shí)向右劃圈;站立時(shí)右側(cè)傾倒。凡具有上述4項(xiàng)體征者列入研究對(duì)象。

缺血再灌注后24h行側(cè)腦室注射。將鼠固定于腦立體定位儀上，暴露顱骨，以顱骨面人字為體表標(biāo)志，參照腦立體定位圖譜，取前囟后0.8mm、左旁開1.2mm，牙科鉆垂直鉆孔，用微量加樣器分別抽吸10μl的Ad-ANG或Ad-GFP垂直進(jìn)針5mm，緩慢注入側(cè)腦室，注射時(shí)間10min，留針5min后緩慢拔出。

1.4 神經(jīng)功能缺失評(píng)分 參照 Zea-Longa法［8］進(jìn)行神經(jīng)病學(xué)評(píng)分，即無(wú)神經(jīng)損傷癥狀為0分，不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪1分，行走時(shí)身體向偏癱側(cè)轉(zhuǎn)圈為2分，行走時(shí)向偏癱側(cè)傾倒或動(dòng)物不能站立或動(dòng)物打滾為3分，無(wú)自發(fā)活動(dòng)、有意識(shí)障礙為4分。采用雙盲法于缺血再灌注時(shí)、側(cè)腦室注射時(shí)及注射后1d、3d、7d、14d 評(píng)分并記錄。

1.5 制備大鼠腦組織切片行熒光檢測(cè)及HE染色 大鼠腹腔麻醉后，經(jīng)左心室插管灌注。在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)將每組大鼠快速灌流生理鹽水250ml(37℃)，再用4%多聚甲醛溶液300ml(4℃)灌流，維持20～30min，迅速取出腦。在大鼠腦切片器中沿視交叉冠狀位切取腦組織，將其置于4%多聚甲醛4℃過夜，換20%蔗糖浸泡至沉底，再換30%蔗糖，待腦組織沉底后 OCT包埋，冰凍切片，制成20μm厚的切片，每隔5張取連續(xù)5張貼片，每只大鼠取5張腦片于熒光顯微鏡下觀察熒光表達(dá)情況。另取一套腦切片行常規(guī)HE染色，脫水封片后于光鏡下觀察。

1.6 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)ANG陽(yáng)性細(xì)胞切片入0.01mol/L PBS水化30min，3%過氧化氫10min，血清封閉1h(室溫)，滴加 ANG(1∶100)抗體50μl于各切片上，入4℃冰箱過夜。次日滴加二抗，室溫下孵育1h。各步驟間均入0.01mol/L PBS搖洗3次，DAB顯色，常規(guī)梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察并計(jì)數(shù)ANG陽(yáng)性細(xì)胞。于室管膜周圍計(jì)數(shù)固定得2個(gè)高倍視野，缺血皮層下計(jì)數(shù)3個(gè)高倍(×40)視野，每組大鼠測(cè)量8張腦片，每張腦片選取固定得相同的5個(gè)位置點(diǎn)。

1.7 微血管密度檢測(cè) 采用兔抗大鼠vWF抗體(1∶800)及改良二步法試劑盒，進(jìn)行免疫組織化學(xué)反應(yīng)，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復(fù)染，封片觀察。微血管密度(MVD)計(jì)數(shù)按 Weidener等［9］方法進(jìn)行，凡染成棕黃色的單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇作為一個(gè)血管計(jì)數(shù)，每張切片在同一皮層缺血區(qū)選擇5個(gè)高倍視野進(jìn)行微血管計(jì)數(shù)，計(jì)算出每1mm2面積內(nèi)微血管的數(shù)量，即微血管密度，然后求其均值。每組大鼠選取5個(gè)腦片進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.8 凋亡細(xì)胞TUNEL染色 采用凋亡細(xì)胞DNA原位末端標(biāo)記法(TUNEL)標(biāo)記凋亡細(xì)胞。按神經(jīng)細(xì)胞及組織原位凋亡檢測(cè)試劑盒操作步驟進(jìn)行染色，顯微鏡下觀察凋亡陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)。選取缺血區(qū)額頂葉皮質(zhì)上部3個(gè)高倍視野，內(nèi)側(cè)尾狀核區(qū)2個(gè)高倍(×40)視野進(jìn)行凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能缺失評(píng)分 腦缺血再灌注大鼠側(cè)腦室注射重組腺病毒后3d及7d，與Ad-GFP對(duì)照組比較，Ad-ANG治療組大鼠神經(jīng)功能缺失評(píng)分顯著降低(P＜0.05)，1d和14d時(shí)兩組間神經(jīng)功能缺失評(píng)分無(wú)顯著差別(見圖1)。

2.2 綠色熒光蛋白的表達(dá) Ad-ANG治療組和Ad-GFP對(duì)照組大鼠側(cè)腦室注射重組腺病毒后1d、3d時(shí)，熒光顯微鏡下可見室管膜周圍及脈絡(luò)叢有較強(qiáng)的綠色熒光，強(qiáng)度顯著高于7d和14d(P＜0.05)，7d后兩組大鼠上述部位熒光較前減弱，14d時(shí)兩組大鼠均僅見脈絡(luò)叢有微弱的綠色熒光，Ad-ANG治療組和Ad-GFP對(duì)照組在各時(shí)間點(diǎn)的熒光強(qiáng)度無(wú)顯著差異。

2.3 HE染色結(jié)果 各組大鼠缺血腦區(qū)均有不同程度神經(jīng)細(xì)胞變性壞死，間質(zhì)水腫，膠質(zhì)細(xì)胞增生;部分呈點(diǎn)片狀，島狀梗死灶，范圍大小不等。與對(duì)照組相比，Ad-ANG治療組壞死區(qū)縮小，上述各種病理表現(xiàn)程度減輕。

2.4 ANG免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 ANG陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色。Ad-ANG治療組大鼠鏡下可見室管膜周及缺血皮層及皮層下大量ANG陽(yáng)性細(xì)胞，側(cè)腦室注射后3d、7d時(shí)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)高于14d(P＜0.05)。Ad-GFP對(duì)照組也有少量ANG細(xì)胞的表達(dá)，主要分布于缺血區(qū)大腦皮質(zhì)及皮質(zhì)下，各時(shí)間點(diǎn)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯低于Ad-ANG治療組(見圖2)。

2.5 缺血腦區(qū)微血管密度分析 vWF免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，缺血腦區(qū)微血管形態(tài)不規(guī)則，管腔由染成棕黃色的內(nèi)皮細(xì)胞圍成，部分血管無(wú)明顯管腔，內(nèi)皮細(xì)胞呈條索狀，有的只見單個(gè)或成簇的內(nèi)皮細(xì)胞。Ad-ANG治療組大鼠側(cè)腦室注射后3、7和14d時(shí)梗死周邊區(qū)可見較多散在的單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞，微血管數(shù)量明顯多于Ad-GFP對(duì)照組(P＜0.01)(見圖3)。

2.6 TUNEL染色結(jié)果 TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞呈棕褐色，胞體縮小，可見核固縮和核破裂，主要分布在腦梗死灶及其周圍。在側(cè)腦室注射后3d、7d、14d，與Ad-GFP對(duì)照組相比，Ad-ANG治療組缺血腦組織凋亡神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目顯著減少(P＜0.05)(見圖4)。

圖1 Ad-ANG治療組和Ad-GFP對(duì)照組大鼠神經(jīng)功能缺失評(píng)分在腦缺血再灌時(shí)、側(cè)腦室注射時(shí)及注射后隨時(shí)間變化趨勢(shì)圖，與Ad-ANG組相比較*P＜0.05

圖2 腦缺血再灌注大鼠側(cè)腦室內(nèi)注射重組ANG腺病毒后腦內(nèi)ANG陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)情況，與Ad-GFP組比較#P＜0.01;與Ad-ANG治療1d組比較a P＜0.05;與Ad-ANG治療14d組比較b P＜0.05

圖3 腦缺血再灌注大鼠側(cè)腦室注射重組腺病毒后不同時(shí)間點(diǎn)缺血皮層微血管密度(血管數(shù)/mm2)

圖4 腦缺血再灌注大鼠側(cè)腦室注射重組腺病毒后不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠缺血腦區(qū)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)

3 討論

腦缺血后梗死灶周圍血管通過新生血管供應(yīng)缺血組織有助于缺血后神經(jīng)功能恢復(fù)，補(bǔ)充外源性促血管生成因子有助于缺血腦區(qū)血管數(shù)目增加，減輕缺血性損害［10，11］。全身給予促血管生長(zhǎng)因子的有益作用依賴于治療的時(shí)間點(diǎn)，腦缺血再灌注后1～3d給予促血管生長(zhǎng)因子可促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)［10］。

血管生長(zhǎng)素ANG是一種單鏈蛋白質(zhì)，分子量為14.4kD，在血管生長(zhǎng)過程中的多個(gè)環(huán)節(jié)均有作用［3］。在生理狀態(tài)下 ，ANG的表達(dá)受到嚴(yán)格的調(diào)控，缺氧及局部浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞分泌TNF2α、IL-1β等因子能誘發(fā)ANG表達(dá)的增加，從而促進(jìn)血管的生成［12］。我們既往研究［6］也發(fā)現(xiàn)大鼠腦缺血后再灌注腦內(nèi)ANG的表達(dá)明顯增高，提示ANG可能參與腦缺血后腦組織的修復(fù)。外源性給予ANG能刺激缺血區(qū)側(cè)支循環(huán)形成和增加局部血流，并且已在外周動(dòng)脈閉塞性模型［4］及慢性心肌缺血模型［5］中成功應(yīng)用。

本實(shí)驗(yàn)中大鼠于腦缺血再灌注24h后側(cè)腦室注射Ad-ANG，熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)綠色熒光蛋白在室管膜周圍以及脈絡(luò)叢表達(dá)，注射3d后表達(dá)最為強(qiáng)烈，14d時(shí)脈絡(luò)叢仍有微弱表達(dá)，并有逐漸向缺血腦區(qū)遷移的趨勢(shì)，提示側(cè)腦室注射重組病毒可以在腦損傷大鼠腦內(nèi)存活，轉(zhuǎn)染的Ad-ANG載體能夠在腦組織內(nèi)表達(dá)，并能向缺血腦區(qū)移行。染色顯示Ad-ANG治療組缺血腦區(qū)間質(zhì)的水腫和神經(jīng)元的受損有明顯減輕，大鼠室管膜周圍及缺血皮層及皮層下可見大量ANG陽(yáng)性細(xì)胞，在注射后3d、7d、14d時(shí)大鼠缺血區(qū)微血管的密度顯著高于Ad-GFP對(duì)照組，提示側(cè)腦室內(nèi)注射Ad-ANG能在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)上調(diào)腦缺血大鼠腦內(nèi)ANG蛋白表達(dá)，促進(jìn)新生血管的生成，在減輕腦缺血性損傷，對(duì)缺血再灌注損傷腦組織有保護(hù)作用。

細(xì)胞凋亡在腦缺血后腦神經(jīng)損害中起著重要作用。抑制缺血后細(xì)胞凋亡是減輕腦缺血損傷的重要手段。本研究觀察到，在側(cè)腦室注射Ad-ANG后3d、7d、14d時(shí)腦梗死灶周圍組織凋亡細(xì)胞數(shù)顯著減少，提示ANG對(duì)腦缺血的保護(hù)作用可能還通過減少神經(jīng)細(xì)胞缺血性凋亡而實(shí)現(xiàn)。

小結(jié):本研究結(jié)果提示重組腺病毒介導(dǎo)的血管生長(zhǎng)素基因轉(zhuǎn)染可以促進(jìn)腦缺血大鼠缺血腦區(qū)新生血管的生成，減輕腦水腫，減少凋亡細(xì)胞數(shù)目等，從而促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)。

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