杏鮑菇菌絲體多糖提取條件的優(yōu)化研究*

郭金龍 邢麗萍 王玉芬 孫國(guó)琴

(1.內(nèi)蒙古清谷新禾有機(jī)食品集團(tuán)有限責(zé)任公司,呼和浩特 010051;2.內(nèi)蒙古大學(xué),呼和浩特 010021;3.內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院,呼和浩特 010030)

杏鮑菇 (Pleurotus eryngii(DC.)Qué l.),別名刺芹側(cè)耳,隸屬于擔(dān)子菌綱,傘菌目,側(cè)耳科,側(cè)耳屬[1]。杏鮑菇菌肉肥厚,質(zhì)地脆嫩,具有杏仁香味和類似鮑魚的口感,適合保鮮、加工,深得人們的喜愛,享有 “平菇王”的美譽(yù)。杏鮑菇寡糖含量豐富,與雙歧桿菌共用,有改善腸胃功能和美容的效果[2],入藥有降血壓、降血脂、降低膽固醇和增強(qiáng)肌體免疫力之功效[3]。多糖是杏鮑菇中具有生物活性的主要有效組分之一,國(guó)內(nèi)研究2003年才見報(bào)道[4]。近幾年的研究結(jié)果表明,杏鮑菇所含的真菌多糖具有抗氧化、降血脂、抑制腫瘤、抗病毒、抗過敏、抗衰老、降低膽固醇和增強(qiáng)機(jī)體免疫的功效[5～7]。杏鮑菇子實(shí)體和液體發(fā)酵菌絲體都可作為多糖提取的原料。俞苓等[4]用熱水浸提結(jié)合酶法試驗(yàn)結(jié)果表明,果膠酶和中性蛋白酶均可大大提高多糖得率,可分別達(dá)368 mg/g粗多糖和176 mg/g粗多糖。侯軍等[8]響應(yīng)面優(yōu)化法能夠提高杏鮑菇菌糠的多糖提取率,最大提取率達(dá)6.43%。

由于子實(shí)體生產(chǎn)周期長(zhǎng),勞動(dòng)強(qiáng)度大,易受氣候影響,產(chǎn)品的產(chǎn)量及質(zhì)量不穩(wěn)定,且子實(shí)體木質(zhì)化程度高,因此人工栽培子實(shí)體的多糖提取利用率較低。而采用生物發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)杏鮑菇菌絲體,周期短、成本低、產(chǎn)量大,具有工業(yè)化生產(chǎn)前景[9]。相關(guān)研究表明,發(fā)酵法獲得的菌絲體和人工栽培的子實(shí)體,不管是多糖含量,還是多糖的藥理效果,兩者都比較接近,在有些情況下菌絲體多糖的含量和藥理效果比子實(shí)體還要好[10]。因此本試驗(yàn)選擇杏鮑菇菌絲體作為原料,探討多糖提取方法,利用正交試驗(yàn)對(duì)熱水浸提法提取杏鮑菇多糖的最佳工藝進(jìn)行了優(yōu)化,為深入研究杏鮑菇菌絲體多糖奠定基礎(chǔ),也為杏鮑菇保健食品的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器 試驗(yàn)材料:通過液體發(fā)酵得到的杏鮑菇菌絲體,無水乙醇、葡萄糖、苯酚、濃硫酸 (以上均為分析純),碘-碘化鉀溶液。所用儀器:貝克曼離心機(jī)64R(3萬轉(zhuǎn))、JY92-2D超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)、電熱鼓風(fēng)干燥箱、HHS型電熱恒溫水浴槽、ZK-2BS型真空干燥箱、BW320S電子天平。

1.2 試驗(yàn)方法

(1)菌絲體發(fā)酵培養(yǎng)。將斜面試管菌種接種于液體搖瓶中,25℃、150 r/min條件下培養(yǎng)7天制成液體母種,然后將母種以2%接種量接入液體搖瓶培養(yǎng)基中,培養(yǎng)10天左右得到菌絲體原料。

多糖提取工藝流程:菌絲體→洗滌→破碎→熱水浸提→離心 (25℃)→上清液真空濃縮→醇析→離心 (4℃)→乙醇洗滌→真空干燥→粗多糖成品。

(2)醇析多糖條件研究。①乙醇加入量的選擇:取濃縮后的浸提液各10 mL,分別加入95%的乙醇10 mL、20 mL、30 mL、40 mL、50 mL,密封,在低溫 (4℃)下放置過夜,收集粗多糖,按照苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量,并計(jì)算多糖得率。②醇析時(shí)間的選擇:取濃縮后的浸提液各10 mL,加入上述試驗(yàn)確定的乙醇量,密封,在低溫下分別放置2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h,收集粗多糖,按照苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量,并計(jì)算多糖得率。

(3)菌絲體細(xì)胞壁破碎方法的研究。菌絲體在熱水浸提前需要進(jìn)行細(xì)胞破碎,目的是提高多糖的溶出率和縮短浸提時(shí)間,試驗(yàn)比較了以下3種方法對(duì)杏鮑菇多糖提取率的影響。

①烘干粉碎法:屬于傳統(tǒng)方法,將菌絲體在60℃電熱鼓風(fēng)干燥箱中烘干,用研缽粉碎,過60目篩。

②超聲破碎法:采用JY92-2D型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī),變輻桿Φ 6,功率600 W。

③低溫凍融法:將菌絲體冷凍 (約-15℃),然后室溫融化,反復(fù)多次。

(4)杏鮑菇菌絲體多糖的浸提條件研究。①浸提溫度選擇試驗(yàn):確定料液比 (菌絲體濕重g/蒸餾水體積mL)為1∶8,浸提時(shí)間1 h不變的條件下,比較不同浸提溫度對(duì)多糖得率的影響,以選擇最佳浸提溫度。②浸提時(shí)間選擇試驗(yàn):在料液比1∶8,及由上述試驗(yàn)確定的浸提溫度不變的條件下,比較不同浸提時(shí)間對(duì)多糖得率的影響,根據(jù)其多糖得率確定最佳浸提時(shí)間。③浸提料液比試驗(yàn):在上述試驗(yàn)確定的最佳溫度、最佳時(shí)間不變的條件下,選擇不同的料液比提取多糖,根據(jù)多糖得率確定最佳料液比。

(5)正交試驗(yàn)。根據(jù)單因子試驗(yàn)確定的條件范圍,通過L9(34)正交試驗(yàn),得出最佳浸提條件。

(6)多糖含量的測(cè)定。稱取粗多糖樣品0.01 g左右,加入100 mL蒸餾水中沸水浴30 min溶解多糖并定容至250 mL,得杏鮑菇多糖溶液。采用苯酚-硫酸比色法[11]測(cè)定吸光度,并計(jì)算多糖含量。

多糖得率 (%)=多糖含量/菌絲體干重×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇加入量對(duì)多糖得率的影響 醇析試驗(yàn)中乙醇加入量對(duì)杏鮑菇多糖得率的影響見圖1。從圖1可知,乙醇加入量1～3倍時(shí)多糖得率漸次明顯增加,說明乙醇加入量小于3倍時(shí),多糖沉淀不完全;而乙醇加入量大于3倍后,多糖得率趨于平緩,說明3倍的乙醇加入量已基本能把多糖完全沉淀下來,再增加乙醇用量意義不大。從經(jīng)濟(jì)角度考慮,選擇3倍為醇析時(shí)的乙醇加入量。

2.2 醇析時(shí)間對(duì)多糖得率的影響 醇析試驗(yàn)中醇析時(shí)間對(duì)杏鮑菇多糖得率的影響見圖2。從圖2可以看出,醇析時(shí)間小于4 h多糖得率增加明顯,說明多糖沉淀不完全;醇析6 h以上曲線變得平緩;8 h后多糖得率無明顯增加,說明此時(shí)多糖已沉淀完全。因此醇析時(shí)間選擇8 h是恰當(dāng)?shù)摹?/p>

2.3 低溫凍融法對(duì)多糖得率的影響 采用低溫反復(fù)凍融的方法處理杏鮑菇菌絲體,并以傳統(tǒng)的烘干粉碎法作對(duì)照,結(jié)果表明,隨著低溫凍融次數(shù)的增加,杏鮑菇多糖得率略有增加,但增加量很小,即使反復(fù)凍融5次,多糖得率仍然在1%左右,遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)烘干粉碎法 (圖3)?？梢姷蜏貎鋈诜ㄆ扑樽饔幂^弱,只適用于細(xì)胞壁較脆弱的微生物菌體,而不適用于細(xì)胞壁較厚的杏鮑菇菌絲體。

圖1 乙醇加入量對(duì)多糖得率的影響

圖2 醇析時(shí)間對(duì)多糖得率的影響

2.4 超聲波法對(duì)多糖得率的影響 采用超聲波以不同方式處理杏鮑菇菌絲體,并以傳統(tǒng)的烘干粉碎法作為對(duì)照,結(jié)果是,只進(jìn)行 10 min超聲破壁而不進(jìn)行熱水浸提,多糖得率比傳統(tǒng)的烘干粉碎法低,僅為超聲處理5 min并進(jìn)行熱水浸提的50.32%。說明超聲處理不能完全取代熱水浸提的作用。超聲處理10 min多糖得率達(dá)到最高,為 4.73%,再繼續(xù)延長(zhǎng)超聲處理時(shí)間,多糖得率反而有下降的趨勢(shì),這可能是因超聲波處理時(shí)間過長(zhǎng),導(dǎo)致多糖結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,糖鏈斷裂,多糖得率下降 (圖4)。因此,應(yīng)選擇超聲處理10 min并進(jìn)行熱水浸提為最佳的處理?xiàng)l件。

2.5 不同浸提溫度對(duì)多糖得率的影響 分別在60℃、70℃、80℃、90℃、沸水 (97℃)時(shí)提取杏鮑菇多糖,測(cè)定多糖得率,結(jié)果為:浸提溫度對(duì)多糖得率有很大影響,80℃以下多糖的浸提得率隨著溫度的升高而明顯增加;80～97℃多糖浸提得率增加趨于平緩;在溫度為97℃的沸騰狀態(tài),多糖得率最高 (圖5)。因此,97℃宜作為杏鮑菇菌絲體多糖的浸提溫度。

2.6 不同浸提時(shí)間對(duì)多糖得率的影響 分別選取浸提時(shí)間1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、3.5 h、4 h提取杏鮑菇多糖,測(cè)定多糖得率,結(jié)果如圖6所示:提取時(shí)間在1～2 h之間,多糖得率是逐漸增大的;繼續(xù)延長(zhǎng)加熱時(shí)間,多糖得率反而漸趨減少。因此,浸提時(shí)間選擇2 h是比較合理的。

2.7 不同料液比對(duì)多糖得率的影響 按照1∶6、1∶8 、 1∶10、 1∶12、1∶14、 1∶16、1∶18、1∶20 的料液比,分別提取杏鮑菇菌絲體多糖,測(cè)定多糖得率的結(jié)果 (圖7),料液比由1∶6到 1∶10時(shí),多糖得率直線上升,繼續(xù)增大加水量多糖得率變化不大。因此,選用1∶10料液比較為合理。

圖3 凍融處理對(duì)多糖得率的影響

圖4 超聲波處理對(duì)多糖得率的影響

圖5 浸提溫度對(duì)多糖得率的影響

圖6 浸提時(shí)間對(duì)多糖得率的影響

2.8 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析 根據(jù)以上單因子試驗(yàn)結(jié)果,3個(gè)因子中最優(yōu)條件分別為:浸提溫度97℃、浸提時(shí)間2 h、料液比1∶10。因此,在正交試驗(yàn)時(shí)各因子的水平依表1選取;試驗(yàn)計(jì)算結(jié)果如表2所示。

從表2可以看出,對(duì)多糖得率的影響,3個(gè)因子中,A因子 (浸提溫度)的極差最大,B因子 (浸提時(shí)間)次之,C因子 (料水比)最小。熱水浸提法提取杏鮑菇菌絲體多糖的最佳工藝組合為A3B3C1,即浸提溫度97℃,浸提時(shí)間3 h,料液比1∶8。但由于浸提時(shí)間2 h和3 h的k值僅相差0.04,而在生產(chǎn)上則要付出更多的能耗。為了達(dá)到最佳的經(jīng)濟(jì)效益,生產(chǎn)上應(yīng)該選組合A3B2C1,即浸提溫度97℃、浸提時(shí)間2 h、料液比1∶8的工藝組合。

運(yùn)用SPSS(13.0)統(tǒng)計(jì)分析軟件[12]對(duì)表2結(jié)果進(jìn)行方差分析,結(jié)果見表3。從表3可以看出,浸提溫度的顯著值(Sig.)為0.033(0.01＜P＜0.05),有顯著性影響;浸提時(shí)間和料液比的顯著值 (Sig.)分別為0.198和0.600(P＞0.05),無顯著影響。說明在所選擇的水平范圍內(nèi),浸提溫度的改變對(duì)多糖得率有顯著的影響,其他2個(gè)因子對(duì)多糖得率的影響不顯著。影響因子重要性順序?yàn)锳＞B＞C。

3 結(jié)論和討論

3.1 結(jié)論

(1)菌絲體細(xì)胞破碎方法選擇超聲波法。低溫凍融法不適合杏鮑菇菌絲體細(xì)胞破碎。超聲波法與烘干粉碎法相比,前者不必將菌絲體烘干,既簡(jiǎn)化了提取工藝,又提高了多糖得率。

(2)醇析時(shí)優(yōu)化工藝條件為:3倍體積95%乙醇沉淀8 h以上。

(3)浸提溫度97℃、浸提時(shí)間2 h、料液比1∶8為最佳浸提工藝條件。在此條件下,菌絲體多糖的提取率可達(dá)6.52%,較未優(yōu)化前提高近1倍。

3.2 討論

(1)杏鮑菇多糖。自從真菌多糖抑制腫瘤的活性被發(fā)現(xiàn)以后,真菌多糖越來越受人們的關(guān)注,成為生物化學(xué)、免疫學(xué)、醫(yī)藥學(xué)和食品科學(xué)等學(xué)科的一個(gè)非?；钴S的研究領(lǐng)域。盛偉等[3]對(duì)來源于白靈菇、杏鮑菇、阿魏菇3種不同菌類的多糖進(jìn)行體外抗氧化活性研究,發(fā)現(xiàn)杏鮑菇對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力最強(qiáng),杏鮑菇子實(shí)體干品中多糖含量高達(dá)9.9%,它與胃腸中的雙岐桿菌共同作用,具有很好的促進(jìn)消化、吸收功能,是理想的美容、保健食品。挖掘食用菌潛力,提高其產(chǎn)品附加值,是食用菌工作者的責(zé)任和義務(wù),我們正在采用離子束誘變技術(shù)試圖提高菌絲體中的多糖含量,同時(shí)必須探索先進(jìn)的提取技術(shù)將其從菌絲體中提取出來。這正是本文研究的要旨。

(2)菌絲體的前處理。多糖的提取方法常用的有熱水浸提法、酸提法、堿提法、酶法等。稀酸、稀堿條件下,易使部分多糖發(fā)生水解,從而破壞多糖的活性結(jié)構(gòu),使多糖的得率減少。用酶法提取雖然條件溫和,但是成本太高。因此,我們采用熱水浸提法,并通過超聲破碎法和低溫凍融法處理菌絲體細(xì)胞來彌補(bǔ)傳統(tǒng)熱水浸提法需要多次浸提,多糖得率低的缺點(diǎn)。

圖7 料液比對(duì)多糖得率的影響

表1 正交試驗(yàn)因子水平表

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

(3)利用正交設(shè)計(jì)優(yōu)化提取工藝。正交設(shè)計(jì)的基本特點(diǎn)是用部分試驗(yàn)來代替全面試驗(yàn),通過對(duì)部分試驗(yàn)結(jié)果的分析,了解全面試驗(yàn)的情況。如本試驗(yàn)對(duì)浸提溫度、浸提時(shí)間、料液比3因子,每個(gè)因子3水平試驗(yàn),若不考慮交互作用,可利用正交表L9(34)安排,試驗(yàn)方案僅包含9個(gè)水平組合,就能反映試驗(yàn)方案包含27個(gè)水平組合的全面試驗(yàn)的情況,找出最佳的生產(chǎn)條件,再參考單因子試驗(yàn)確定各因素的水平,利用正交試驗(yàn)得出浸提時(shí)的最佳浸提工藝條件,并通過工業(yè)生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)核算,最終確定生產(chǎn)中的最佳浸提工藝條件,為食用菌的精深加工提供科學(xué)技術(shù)依據(jù)。

表3 試驗(yàn)結(jié)果的方差分析

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