‘金薄香’核桃新品種同工酶分析初報(bào)

王勇，張海濤，楊曉宇，趙士粵，溫映紅，武彥霞，劉朝紅，田鑫

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 果樹研究所，山西 太谷030815）

‘金薄香’核桃是山西省農(nóng)科院果樹研究所以新疆優(yōu)質(zhì)薄皮核桃為母本采用實(shí)生選種法經(jīng)過20多年選育而成的1～8號(hào)系列早實(shí)薄殼優(yōu)良新品種。近年來研究［1，2］表明，植物的表型特性遺傳是數(shù)量性狀遺傳，有分離現(xiàn)象，是由多基因控制的性狀。植物的一些優(yōu)良表型性狀，通過同工酶分析，可作為品種鑒定、苗木繁殖、遺傳多態(tài)性分析的依據(jù)。為深入了解‘金薄香’核桃新品種的遺傳特性，本試驗(yàn)以‘金薄香’8個(gè)核桃新品種為試材，對(duì)其品種間同工酶酶譜的差異進(jìn)行研究，以期探究核桃性狀的遺傳規(guī)律。利用同工酶作為遺傳信息表達(dá)的指標(biāo)，從遺傳角度探討各品種分類性狀的價(jià)值及品種間的親緣關(guān)系，并為尋找早實(shí)核桃基因表達(dá)及分子標(biāo)記等一系列研究提供基礎(chǔ)［3～5］。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所選用材料為山西省農(nóng)科院果樹所試驗(yàn)園的‘金薄香’核桃母株。采樣時(shí)期及部位：于2010年7月15日取自上而下第三功能葉片。

1.2 方法

試材葉片，采后立即放于編號(hào)的密封袋內(nèi)，投入冰盒內(nèi)并帶回實(shí)驗(yàn)室。用蒸餾水將葉片沖洗干凈，用濾紙吸干表面水分并用電子天平稱取1.0g，剪碎后放入研缽進(jìn)行液氮研磨，轉(zhuǎn)入10mL離心管內(nèi)，再加入6mL樣品提取液，低溫靜置后置于高速冷凍離心機(jī)，溫度調(diào)至0～4℃，轉(zhuǎn)速12 000 r·min－1，離心20min，取上清液電泳。

采用不連續(xù)垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳，依次在樣品槽內(nèi)加樣后在電泳槽內(nèi)緩慢加入電極緩沖液，滴加溴酚藍(lán)指示劑，接通電源開始電泳，預(yù)電壓為穩(wěn)壓120V，當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑進(jìn)入分離膠后將電壓調(diào)至穩(wěn)壓240V，電泳槽置于4℃冰箱內(nèi)進(jìn)行電泳。當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑距分離膠底面1～2cm時(shí)結(jié)束電泳后，進(jìn)行POD，SOD，AMY，PPO四種同工酶的染色。

過氧化物酶POD染色［6］：取醋酸聯(lián)苯胺溶液（2g聯(lián)苯胺溶于18mL冰醋酸，加水72mL）1 mL，3%過氧化氫0.4mL，加水至20mL（臨用現(xiàn)配），將膠板置于上述染色液中，在37℃下保溫10min。

淀粉酶AMY染色［6］（負(fù)染）：膠板在1%淀粉溶液（用0.04mol·L－1pH 7.0 的磷酸緩沖液配制）中于25℃保溫30min，用0.04mol·L－1pH 7.0磷酸緩沖液洗滌10min ，再浸入0.005 mol·L－1I2－KI試劑中，輕微振蕩數(shù)分鐘。

以上染色后的膠板用雙蒸水沖洗，置于5%醋酸中保存，拍照或描模式圖譜。

超氧化物歧化酶（SOD）染色方法：將膠板沖洗1～2次，置于含0.25mol·L－1NBT的0.05mol·L－1，pH 7.8磷酸鹽緩沖液內(nèi)黑暗振蕩染色20 min，棄去染液；再將膠板置于含0.01%核黃素的0.05mol·L－1，pH 7.8磷酸鹽緩沖液內(nèi)黑暗振蕩染色20min，棄去染液；最后將其置于含0.1mmol·L－1EDTA的0.05mol·L－1，pH 7.8磷酸鹽緩沖液中，在距膠板10cm處40W日光燈光照15～20min即可看到淺紫色背景下的白色條帶。蒸餾水漂洗1～2次后拍照記錄。

多酚氧化酶（PPO）酶染色方法：將膠板置于50mL 0.01%對(duì)苯二胺，150mL 1%鄰苯二酚，50 mL 0.05mol·L－1，pH 6.8磷酸鹽緩沖液的混合染色液中，于30℃恒溫振蕩染色30min，棄掉染色液，加入脫色液振蕩脫色至紅褐色條帶清晰為止。

相對(duì)遷移率Rf的計(jì)算公式如下：

酶帶遷移率 ＝ 酶帶遷移距離／溴酚藍(lán)指示劑遷移距離。

2 結(jié)果與分析

2.1 淀粉酶AMY同工酶酶帶分析

如圖1所示，自右到左分別為‘金薄香’1號(hào)到8號(hào)。如圖譜所示，統(tǒng)計(jì)每個(gè)品種各自的酶帶數(shù)，8個(gè)品種都有3條基本的共有譜帶，其表達(dá)量較高。6號(hào)、7號(hào)除基本共有譜帶外，還有一條特異性酶帶。除6號(hào)外，其他7個(gè)品種還有一條基本的共有酶帶，表達(dá)量較弱。根據(jù)淀粉酶酶帶A2可區(qū)別6號(hào)、7號(hào)與其他品種。采用AMY同工酶分析法可以對(duì)‘金薄香’品種間進(jìn)行輔助鑒定。

圖1 AMY同工酶酶帶分析圖Fig.1 Amylase isoenzymes bands of Jinboxiang Series Walnut

2.2 多酚氧化酶PPO同工酶酶帶分析

如圖2所示，自右到左分別為金薄香1號(hào)到8號(hào)。由圖2可看出，PPO酶帶較少，統(tǒng)計(jì)每個(gè)品種各自的酶帶數(shù) ，計(jì)算其各自酶帶的相對(duì)遷移率，8個(gè)品種都有3條基本的共有譜帶，遷移率分別為0.47，0.50和0.53，表達(dá)量較高，并無特異性差異酶帶。1號(hào)、3號(hào)、4號(hào)多酚氧化酶表達(dá)量最高，2號(hào)、7號(hào)表達(dá)量中等，5號(hào)、6號(hào)表達(dá)量最低。根據(jù)多酚氧化酶酶帶不能鑒別金薄香系列核桃品種。采用PPO同工酶分析法不能對(duì)‘金薄香’品種間進(jìn)行輔助鑒定，不作為較為方便和有效的手段。

圖2 PPO同工酶酶帶分析圖Fig.2 Polyphenol oxidase isoenzymes bands of Jinboxiang Series Walnut

2.3 超氧化物歧化酶SOD同工酶酶帶分析

如圖3所示，自右到左分別為金薄香1號(hào)到8號(hào)。根據(jù)酶譜電泳分離特性劃分區(qū)帶，按照從陰極到陽極的順序，可將“金薄香”系列核桃的SOD同工酶譜帶大致分為2個(gè)區(qū)，分別是SODA區(qū)和SODB區(qū)。按照從陰極到陽極的方向依照所屬區(qū)間再用數(shù)字編號(hào)，統(tǒng)計(jì)每個(gè)品種各自的酶帶數(shù)，計(jì)算出各自酶帶的相對(duì)遷移率，由圖3可看出，2號(hào)、4號(hào)、5號(hào)、7號(hào)和8號(hào)第一區(qū)（SODA區(qū)）的共同酶帶位置有3個(gè)，電泳遷移率分別指示為0.19，0.24和0.27。3號(hào)、6號(hào)品種都無此酶帶。第二區(qū)（SODB區(qū)）中8個(gè)品種都有8條基本的共有譜帶，其遷 移 率分別為 0.46，0.48，0.51，0.54，0.58，0.62，0.66，0.79。從電泳圖譜和酶帶數(shù)統(tǒng)計(jì)來看，2號(hào)、5號(hào)、7號(hào)和8號(hào)的電泳圖譜完全相同外，其他每一個(gè)品種的SOD同工酶圖譜都具有特異性，相互之間區(qū)別明顯。1號(hào)有一條特異性酶帶S4，遷移率為0.42。3號(hào)、4號(hào)、7號(hào)缺少遷移率為0.42的酶帶S5。因此，采用SOD同工酶分析法可以對(duì)‘金薄香’品種間進(jìn)行輔助鑒定。

圖3 SOD同工酶酶帶分析圖Fig.3 Superoxide dismutase isoenzymes bands of＇Jinboxiang＇Series Walnut

2.4 過氧化物POD同工酶酶帶分析

如圖4所示，自右到左分別為金薄香1號(hào)到8號(hào)。過氧化物酶酶帶較少，統(tǒng)計(jì)每個(gè)品種各自的酶帶數(shù)，計(jì)算出各自酶帶的相對(duì)遷移率，8個(gè)品種都有4條基本的共有譜帶P1，P2，P3，P4，遷移率分別為0.36，0.37，0.41，0.44。Rf＝0.47酶譜帶P5為8號(hào)的特有帶，Rf＝0.55，Rf＝0.59兩條酶帶P6和P7是1號(hào)、3號(hào)、4號(hào)的共有酶帶。根據(jù)過氧化物酶特異性酶帶P5可鑒定8號(hào)，酶帶P6和P7可區(qū)別1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)、4號(hào)與其他品種。采用POD同工酶分析法對(duì)‘金薄香’品種間進(jìn)行輔助鑒定是一種較為方便和有效的手段。

圖4 POD同工酶酶帶分析圖Fig.4 Peroxidase isoenzymes bands of＇Jinboxiang＇Series Walnut

3 小結(jié)與討論

同工酶是一種特異蛋白質(zhì)，是基因（DNA片段）表達(dá)的直接產(chǎn)物，不同基因組成會(huì)在同工酶譜上表現(xiàn)出來，即同工酶是基因分子水平的表現(xiàn)型，是基因和外在性狀的連接物，基因的微小變化會(huì)引起同工酶的變化。因此，可從同工酶譜的變化及酶譜特征了解品種間的親緣關(guān)系和品種間的差別。植物在進(jìn)化過程中，形成了不同親緣關(guān)系的物種，一定的親緣關(guān)系反映了植物在基因型上存在某種相關(guān)性，分類學(xué)中一般依據(jù)物種所表現(xiàn)的性狀來判斷這種聯(lián)系。同工酶是基因表達(dá)的產(chǎn)物，可以從同工酶酶譜的分析來識(shí)別基因的存在和表達(dá)，種與種或品種之間，酶譜的共同特征越多，說明親緣關(guān)系越近。

聚丙烯酰胺凝膠電泳的垂直板型電泳法是近年來用途較廣的一種相對(duì)含量的測(cè)定方法。它的優(yōu)點(diǎn)是在同一條件下可以電泳多個(gè)樣品，便于相互比較；另外還可以制成干板便于掃描、攜帶和保存。

采用AMY、SOD、POD同工酶3種分析法，‘金薄香’核桃品種間同工酶帶差異較明顯，可以作為對(duì)‘金薄香’品種進(jìn)行輔助鑒定的有效方法。而采用PPO同工酶分析法，同工酶帶差異不顯著，不能作為對(duì)此品種進(jìn)行輔助鑒定的方法。

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