PLIN基因多態(tài)性及其與綿羊尾形和屠宰性狀的關(guān)聯(lián)研究

高中元，林婄婄，袁亞男，周沙沙，劉寶鳳，劉建華，梁 琛，喬利英，劉文忠

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，山西 太谷030801）

脂滴包被蛋白（perilipin）是一種可磷酸化的脂滴相關(guān)磷蛋白［1］，由PLIN基因編碼，在蛋白激酶A調(diào)控的脂肪代謝中具有重要作用［2，3］。在人和小鼠上的研究表明，PLIN基因主要在脂肪組織中表達(dá)［4，5］，對(duì)脂肪組織中甘油三酯的儲(chǔ)存和分解具有重要的雙重調(diào)控作用［6，7］，在類固醇生成細(xì)胞中有少量表達(dá)，主要調(diào)控膽固醇酯、類固醇激素合成前體的分解［8］。PLIN基因敲除的小鼠瘦體重（lean body mass）較大，脂肪細(xì)胞較小，表明它能增加瘦素（leptin）的表達(dá)，并且能夠抵抗飲食誘導(dǎo)的肥胖［9］。對(duì)人類的研究發(fā)現(xiàn)，PLIN基因在肥胖個(gè)體的脂肪組織中過量表達(dá)［10］，且該基因的單核苷酸多態(tài)性（SNP）與體脂重、低體重指數(shù)、肥胖風(fēng)險(xiǎn)以及總膽固醇水平關(guān)聯(lián)［11～13］。對(duì)豬PLIN基因的研究表明，PLIN基因多態(tài)性與豬的平均日增重、瘦肉率和背膘厚關(guān)聯(lián)［14］。對(duì)秦川牛的研究表明，PLIN基因多態(tài)性對(duì)脂肪沉積有一定影響，可作為改善牛肉品質(zhì)和肉牛品種改良的候選基因［15］。

然而，PLIN基因在綿羊上的研究還未見報(bào)道。尾部是綿羊脂肪沉積和能量存儲(chǔ)的重要部位，尾形的差異可能反映脂肪代謝水平的不同。鑒于該基因?qū)C(jī)體脂肪代謝的重要作用，本研究以PLIN基因?yàn)槟康幕?，采用PCR－SSCP方法，檢測(cè)兩個(gè)具有明顯尾形差異的綿羊品種的PLIN基因多態(tài)性，并分析這些多態(tài)與尾形和屠宰性狀可能存在的關(guān)聯(lián)，為肉用綿羊品種改良提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

廣靈大尾羊（Guangling Large Tailed sheep，GLT）和小尾寒羊（Small Tailed Han sheep，STH）都起源于蒙古羊，同屬于脂尾型綿羊，但尾型差異顯著。廣靈大尾羊?qū)匍L(zhǎng)脂尾型綿羊，尾大蓄脂力強(qiáng)，肉用性能好，但繁殖力低；小尾寒羊?qū)俣讨残途d羊，尾小蓄脂力弱，肉用性能一般，但繁殖力高［16，17］。

血樣采自2、4、6、8、10和12月齡健康狀況良好的廣靈大尾羊和小尾寒羊。每品種每階段8只，公母各半，共計(jì)96只。宰前稱空腹重，測(cè)量尾長(zhǎng)和尾寬，每個(gè)個(gè)體頸靜脈采血10 mL，加入2 mL ACD抗凝劑，－70℃保存?zhèn)溆?。宰后稱胴體重和尾脂重，計(jì)算屠宰率和相對(duì)尾脂重（尾脂重／胴體重）。

1.2 基因組DNA的提取

采用常規(guī)的酚－氯仿抽提法提取綿羊血樣基因組DNA，提取的DNA用TE緩沖液溶解稀釋，然后用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，并用核酸濃度測(cè)定儀測(cè)定DNA濃度，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PLIN基因引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增

引物設(shè)計(jì)，根據(jù)Gen Bank提供的綿羊PLIN基因 mRNA序列（NM＿001113773.1）及牛PLIN基因序列（NC＿007319），利用 Pri mer 3 Plus（http：／／www.bioinfor matics.nl／cgi－bin／pri mer3plus／pri mer3plus.cgi）在線設(shè)計(jì)引物，每個(gè)外顯子設(shè)計(jì)1對(duì)引物，共設(shè)計(jì)9對(duì)引物，包含整個(gè)編碼區(qū)序列（表1）。

表1 引物序列、產(chǎn)物大小及退火溫度Table 1 Primer sequence，product sizes and annealing temperature

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為15μL：模板DNA 1 μL，上下游引物各0.6μL，10×Buffer緩沖液1.5 μL，d NTP 1.2μL，Taq DNA 聚合酶0.3μL，滅菌dd H2O 9.8μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃4 min；94℃30 s、退火30 s、72℃30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min；4℃保存。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.4 PCR產(chǎn)物的SSCP分析

將1μL PCR產(chǎn)物和9μL緩沖液混合，98℃變性10 min，冰浴20 min，使產(chǎn)物保持變性狀態(tài)，在1×TBE電泳緩沖液中用12%的非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，先300 V高電壓電泳15 min，再130 V電壓電泳過夜，電泳結(jié)束后銀染顯色并照相、分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

1.5.1 基因頻率和基因型頻率

等位基因頻率、基因型頻率、雜合度、純合度以及有效等位基因數(shù)用Arlequin軟件［18］計(jì)算，用POPGENE軟件［19］進(jìn)行哈代－溫伯格平衡（Hardy－Weinberg equilibriu m，H WE）檢驗(yàn)。用SPSS 17.0軟件（SPSS Science，Chicago，IL，USA）進(jìn)行PLIN基因型在兩個(gè)群體間分布差異的顯著性檢驗(yàn)。

1.5.2 多態(tài)信息含量

用多態(tài)信息含量（Pol y mor phis m Infor mation Content，PIC）估計(jì)PLIN基因的多態(tài)性，表示該基因的變異程度。PIC＞0.5為高度多態(tài)，0.25＜PIC＜0.5為中度多態(tài)，PIC＜0.25為低度多態(tài)，利用Botstein等［20］的公式計(jì)算。

1.5.3 關(guān)聯(lián)分析模型

PLIN基因多態(tài)位點(diǎn)遺傳效應(yīng)用SPSS 17.0軟件（SPSS Science，Chicago，IL，USA）中的一般線性模型（GL M）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，GL M為：

式中：yijklm為性狀表型值，μ為總體均值，Bi為第i個(gè)品種效應(yīng)（i＝1，2），Sj為第j個(gè)性別效應(yīng)（j＝1，2），Mk為第k個(gè)月齡（k＝2，4，…，12），Gl為第l種基因型效應(yīng)，eijklm為殘差效應(yīng)。

2 結(jié)果

2.1 PLIN 基因PCR－SSCP結(jié)果

對(duì)PLIN基因9個(gè)外顯子擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行SSCP檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，外顯子3～6和8存在多態(tài)性（圖1），其中外顯子3、4、6檢測(cè)出了A、B兩個(gè)等位基因，三種基因型；外顯子5檢測(cè)出了A、B兩個(gè)等位基因，AA、AB兩種基因型；外顯子8檢測(cè)出了A、B、C三個(gè)等位基因，AA、AB、AC三種基因型。

圖1 PLIN 基因外顯子3、4、5、6、8擴(kuò)增產(chǎn)物PCR－SSCP電泳結(jié)果Fig.1 The PCR－SSCP of amplified products of PLIN gene

2.2 基因型頻率和等位基因頻率

兩個(gè)綿羊品種PLIN基因不同外顯子的基因型頻率和等位基因頻率見表2。在廣靈大尾羊和小尾寒羊兩個(gè)品種中，外顯子3、4、6中AA基因型頻率和A等位基因頻率都明顯高于BB基因型頻率和B等位基因頻率；外顯子5和8中A等位基因頻率顯著高于B等位基因頻率，未檢測(cè)出BB基因型；外顯子8中檢測(cè)出了AC基因型，未檢測(cè)出BB基因型，且C等位基因頻率顯著低于A等位基因頻率。

表2 兩個(gè)綿羊品種PLIN基因各外顯子的基因型頻率和等位基因頻率Table 2 Genotype and allele frequencies of exons in PLIN gene in two sheep breeds

PLIN基因不同多態(tài)位點(diǎn)的純合度（Homozygosity，Ho）、雜合度（Heter ozygosity，He）、有效等位基因數(shù)（Effective number of allele，Ne）以及H WE檢驗(yàn)、卡方獨(dú)立性檢驗(yàn)結(jié)果見表3。廣靈大尾羊和小尾寒羊都是第5外顯子多態(tài)位點(diǎn)純合度最高；H WE檢驗(yàn)結(jié)果表明外顯子4多態(tài)位點(diǎn)在兩個(gè)品種中都不平衡，外顯子3多態(tài)位點(diǎn)在小尾寒羊群體中不平衡，而其他位點(diǎn)處于H WE。

卡方獨(dú)立性檢驗(yàn)表明，外顯子3的基因型頻率在廣靈大尾羊和小尾寒羊品種間存在顯著差異（P＜0.05），而其他外顯子的基因型頻率無品種差異。

表3 PLIN基因各外顯子的遺傳多樣性指數(shù)和哈代－溫伯格平衡檢驗(yàn)Table 3 The genetic diversity indices and Hardy－Weinberg equilibrium test of PLIN gene

2.3 PLIN基因各外顯子的多態(tài)信息含量

除外顯子5外，其余4個(gè)外顯子的PIC介于0.25～0.5間，反映了以往并未對(duì)該基因進(jìn)行過高度選育，在兩個(gè)品種均呈中度遺傳多態(tài)；外顯子5的多態(tài)信息含量極低，遺傳一致性較高。

2.4 PLIN基因多態(tài)性對(duì)尾形和屠宰性狀的影響

不同品種、性別、月齡各因素各水平下尾形和屠宰性狀的均值和標(biāo)準(zhǔn)誤見表4。因未測(cè)小尾寒羊的尾脂重，難以確切地說明品種間的差異。但除屠宰率外，所有其他性狀均是廣靈大尾羊顯著地（P＜0.05）大于小尾寒羊，公羊大于母羊。這些結(jié)果也進(jìn)一步佐證了廣靈大尾羊的肉用性能優(yōu)于小尾寒羊。所有性狀月齡間差異顯著，且基本隨月齡的增大而增加。

表4 品種、性別和月齡對(duì)尾形和屠宰性狀的影響Table 4 Effects of breed，sex and month of age on tail and slaughter traits

在考慮上述各因素的同時(shí)，對(duì)PLIN基因的多態(tài)性與有關(guān)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果（表5）表明，外顯子4和6的多態(tài)性顯著影響相對(duì)尾脂重（P＜0.05），其中外顯子4的BB型個(gè)體（0.14）的相對(duì)尾脂重顯著大于 AA（0.11）和 AB型（0.09）個(gè)體；而外顯子6的AA型個(gè)體（0.13）的相對(duì)尾脂重顯著大于 AB（0.11）和 BB型（0.10）個(gè)體；外顯子5的多態(tài)性對(duì)尾寬的影響極顯著（P＜0.01），其中AA型個(gè)體（15.71 c m）顯著大于 AB型個(gè)體（10.86 c m）。

3 結(jié)論與討論

3.1 PLIN基因多態(tài)性

PLIN基因編碼的perilipin是一種脂滴相關(guān)磷蛋白，研究表明，perilipin磷酸化是激素敏感脂酶（HSL）從胞漿轉(zhuǎn)位至脂滴表面發(fā)揮脂解作用的必要條件之一［21］，在脂肪代謝中具有重要作用［6，7］。

Vykoukaloval等［14］對(duì)豬PLIN 基因多態(tài)性進(jìn)行了研究，在外顯子2、3、5、6和7中發(fā)現(xiàn)了8個(gè)突變、3種基因型，而本研究在外顯子3、4、6、8中都檢測(cè)出了3種基因型，在外顯子5中檢測(cè)出兩種基因型，且除外顯子5多態(tài)信息含量極低，其他外顯子在兩個(gè)品種均呈中度遺傳多態(tài)。比較而言，綿羊PLIN基因多態(tài)比較豐富，為綿羊良種的選育提供了一定的選擇空間。樊月圓等［15］檢測(cè)了秦川牛PLIN基因第3、4外顯子多態(tài)性，每個(gè)外顯子都發(fā)現(xiàn)了3種基因型，與本研究結(jié)果相近。這是否說明牛羊親緣關(guān)系相近，PLIN基因在該二畜種中的遺傳變異相似，尚待進(jìn)一步研究。

表5 PLIN基因多態(tài)性和尾形和屠宰性狀的關(guān)聯(lián)分析Table 5 Associations bet ween the poly morphism of PLl N gene and tail and slaughter traits

3.2 兩個(gè)綿羊品種的遺傳差異

廣靈大尾羊主要分布在山西省的雁北地區(qū)，以產(chǎn)肉為主，肉用性能好，是蒙古羊進(jìn)入農(nóng)區(qū)后經(jīng)過長(zhǎng)期選擇、閉鎖繁育而形成的［16］；小尾寒羊主要分布于山東省的西南地區(qū)，主要特點(diǎn)是繁殖力高，但肉用性能一般，是蒙古羊進(jìn)入自然環(huán)境較好的中原地區(qū)，經(jīng)過長(zhǎng)期的自然和人工選擇而成［17］，因此品種間性狀和遺傳差異較大。本研究中，除屠宰率外，所有其他性狀均是廣靈大尾羊顯著地大于小尾寒羊，進(jìn)一步揭示了兩品種間的性能差異。

外顯子3在小尾寒羊中處于遺傳不平衡狀態(tài)，而在廣靈大尾羊中則平衡，并且PLIN基因外顯子3的基因型頻率品種間差異顯著（P＜0.05），這也進(jìn)一步證明了品種間遺傳差異的存在。廣靈大尾羊和小尾寒羊都是外顯子5的純合度最高，各外顯子的有效等位基因數(shù)品種間差異不顯著，且除外顯子3外，其他外顯子的基因型頻率無品種差異。這一方面表明起源相同的兩個(gè)綿羊品種在遺傳上具有一致性，另一方面也說明了基因的保守性。

3.3 PLIN基因多態(tài)性對(duì)綿羊尾形和屠宰性狀的遺傳效應(yīng)

動(dòng)物脂肪的沉積主要取決于脂肪細(xì)胞的體積與數(shù)量［22］，而PLIN基因編碼的perilipin對(duì)脂肪代謝具有重要的調(diào)控作用［2，3］，可以作為改善脂肪沉積的候選基因。人類以及畜禽上都發(fā)現(xiàn)了多個(gè)SNP位點(diǎn)，對(duì)人的11482G＞A位點(diǎn)研究較多，且該位點(diǎn)主要與肥胖和血脂指標(biāo)相關(guān)［23］。趙小玲研究發(fā)現(xiàn)的3個(gè)SNP位點(diǎn)分別對(duì)肌內(nèi)脂肪含量、胸肌重和胴體重有顯著地遺傳效應(yīng)［24］。本研究中PLIN基因外顯子4和6的多態(tài)性對(duì)綿羊相對(duì)尾脂重影響顯著，外顯子5的AA型個(gè)體的尾寬極顯著地大于AB型個(gè)體（P＜0.01），進(jìn)一步說明了PLIN基因在綿羊脂肪沉積中的功能。與樊月圓等［15］研究結(jié)果一致，該基因可以作為影響胴體和肉質(zhì)的候選基因，指導(dǎo)肉用綿羊的育種工作。

另外，本研究發(fā)現(xiàn)外顯子5和6中等位基因A都為群體中的優(yōu)勢(shì)等位基因，且含有A等位基因的個(gè)體，其相對(duì)尾脂重和尾寬顯著大于其他個(gè)體，表明這樣的個(gè)體脂肪沉積能力顯著優(yōu)于其他個(gè)體。由此，我們推測(cè)等位基因A可能影響綿羊的胴體和肉質(zhì)性狀，其結(jié)果還需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

綜上所述，PLIN基因多態(tài)性對(duì)小尾寒羊和廣靈大尾羊的尾寬和相對(duì)尾脂重有顯著影響，具有沉積脂肪的功能，可以作為改善綿羊脂肪沉積能力、提高肉質(zhì)性狀的候選基因。有關(guān)結(jié)果可以指導(dǎo)肉用綿羊的遺傳改良，加快良種培育。

［1］Greenberg A S，Egan J J，Wek S A，etal.Perilipin，a major hor monally regulated adipocyte－specific phosphoprotein associated with the periphery of lipid storage droplets［J］.J Biol Chem，1991，266：11341－11346.

［2］Zhang H H，Souza S C，Muliro K V，etal.Lipase－selective f unctional domains of perilipin A differentially regulate constitutive and protein kinase A－sti mulated lipolysis［J］.J Biol Chem，2003，278：51535－51542.

［3］Miyoshi H，Perfield J W，Souza S C，etal.Contr ol of adipose triglyceride lipase action by serine 517 of perilipin A globally regulates protein kinase A－sti mulated lipolysis in adipocytes［J］.J Biol Chem，2007，282：996－1002.

［4］Nishiu J，Tanaka T，Nakamura Y.Isolation and chr o moso mal mapping of the hu man ho molog of perilipin（PLIN），a rat adipose tissuespecific gene，by differential display met hod［J］.Geno mics，1998，48：254－257.

［5］Lu X，Gr uia－Gray J，Copeland N G，etal.The murine perilipin gene：the lipid dr oplet－associated perilipins derive fr o m tissue－specific，mRNA splice variants and define a gene fa mily of ancient origin［J］.Mamm Geno me，2001，12：741－749.

［6］Souza S C，Vargas L M，Ya ma moto M T，etal.Overexpression of perilipin A and B blocks the ability of tu mor necrosis factorαto increase lipolysis in 3 T3－L1 adipocytes［J］.J Biol Chem，1998，273：24665－24669.

［7］Brasaemle D L，Rubin B，Harten I A，etal.Perilipin A increases triacylglycer ol st orage by decreasing the rate of triacylglycerol hydr olysis［J］.J Biol Che m，2000，275：38486－38493.

［8］Ser vet nick D A，Brasaemle D L，Gr uia－Gray J，etal.Perilipins are associated wit h cholesteryl ester dr oplets in steroidogenic adrenal cortical and Leydig cells［J］.J Biol Chem，1995，270：16970－16973.

［9］Tansey J T，Sztalryd C，Gr uia－Gray J，etal.Perilipin ablation results in a lean mouse wit h aberrant adipocyte lipolysis，enhanced leptin production，and resistance t o diet－inducedobesity［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2001，98：6494－6499.

［10］Ker n P A，Di Gregorio G，Lu T，etal.Perilipin expression in hu man adipose tissue is elevated wit h obesity［J］.J Clin Endocrinol Metab，2004，89：1352－1358.

［11］Qi L，Corella D，SorlíJ V，etal.Genetic variation at the perilipin（PLIN）locus is associated wit h obesit y－related phenot ypes in White women［J］.Clin Genet，2004，66：299－310.

［12］Qi L，Haiqing S，Larson I，etal.Gender－specific association of a perilipin gene haplotype wit h obesity risk in a White population［J］.Obes Res，2004，12：1758－1765.

［13］Yan W，Chen S，Huang J，etal.Poly mor phisms in PLIN and hypertension combined wit h obesity and lipid profiles in Han Chinese［J］.Obes Res，2004，12：1733－1737.

［14］Vykoukalová1 Z，Knoll A，ˇCepica S.Porcine perilipin（PLIN）gene：structure，poly mor phis m and association st udy in Large White pigs［J］.J Ani m Sci，2009，54：359－364.

［15］樊月圓，昝林森，王洪寶，等.PLIN基因多態(tài)性與秦川牛胴體、肉質(zhì)性狀的相關(guān)性研究［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2010，41：268－273.

［16］呂效吾.山西省家畜家禽品種志 ［M］.上海：華東師范大學(xué)出版社，1984.

［17］王建民，秦孜娟，曲緒仙，等.山東小尾寒羊種質(zhì)特性及利用途徑的研究進(jìn)展（上）［J］.草食家畜，1997，（3）：6－10.

［18］Excoffier L，Lischer HE.Arlequin suite ver 3.5：A new series of progra ms to perfor m population genetics analyses under Linux and Windows［J］.Mol Ecol Resour，2010，10：564－567.

［19］Yeh FC，Boyle T，Yang R.POPGENE version 1.31 Microsoft windo w based freeware for population genetic analysis［M］.Univesity of Al berta，Ed mont on，1999.

［20］Botstein D，White R L，Skol nick M，etal.Constr uction of a genetic linkage map in man using restriction frag ment lengt h poly morphis ms［J］.Am J Hu m Genet，1980，32：314－331.

［21］Sztalr yd C，Xu G，Dor ward H，etal.Perilipin A is essential for the translocation of hor mone－sensitive lipase during lipolytic activation［J］.J Cell Biol，2003，161：1093－1103.

［22］Nishi mura T，Hattori A，Takahashi K.Str uct ural changes in intra muscular connective tissue during the fattening of Japanese black cattle：effect of mar bling on beef tenderization［J］.J Ani m Sci，1999，77：93－104.

［23］Mottagui－Tabar S，Rydén M，L?f gren P，etal.Evidence for an important r ole of perilipin in the regulation of hu man adipocyte lipolysis［J］.Diabet ologia，2003，46：789－797.

［24］趙小玲.雞ADFP和PLIN基因與脂肪組織生長(zhǎng)發(fā)育關(guān)系的遺傳學(xué)研究 ［D］.雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.