• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    GATA-4在不同能量水平下綿羊睪丸中的表達(dá)與定位分析

    2012-10-26 11:08:34楊慧妮武曉英張春香任有蛇岳文斌
    關(guān)鍵詞:生精睪丸免疫組化

    楊慧妮,武曉英,2,張春香,任有蛇,岳文斌

    (1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院,山西 太谷030801;2.太原師范學(xué)院 生物系,山西 太原030006)

    轉(zhuǎn)錄因子GATA-4是具有鋅指結(jié)構(gòu)的GATA家族中的第四個(gè)成員。該家族轉(zhuǎn)錄因子具有與特定DNA結(jié)合的鋅指結(jié)構(gòu)域,在進(jìn)化過(guò)程中高度保守[1]。1996年 Huang等[2]應(yīng)用原位雜交技術(shù)將人的GATA-4定位于8p23.1→p22,c DNA 全長(zhǎng)3372 bp,有6個(gè)外顯子,編碼442個(gè)氨基酸。GATA-4在中胚層和內(nèi)胚層起源的組織中廣泛表達(dá)(如心臟、睪丸和卵巢等)。最初發(fā)現(xiàn)GATA-4可以調(diào)控心臟發(fā)育,隨后證明它是成年心臟肥大的一個(gè)重要調(diào)控因子。GATA-4調(diào)控多種基因的表達(dá),其調(diào)控作用在心臟、生殖系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和癌癥中均占有重要地位。因此GATA-4的正反調(diào)控是其生物功能的重要組分[3]。

    在過(guò)去十年中,大量研究了轉(zhuǎn)錄因子GATA在人類(lèi)疾病中的作用[4]。目前GATA-4已成為研究的焦點(diǎn),表明其在雄性性別決定、類(lèi)固醇激素合成和細(xì)胞存活上有重要作用。尤其是在哺乳動(dòng)物的繁殖有多個(gè)途徑的調(diào)控上,可能有著決定性作用[5]。國(guó)外研究表明,GATA-4轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)于Sertoli細(xì)胞,類(lèi)固醇合成的睪丸Leydig細(xì)胞和其他睪丸體細(xì)胞[6],這說(shuō)明GATA-4轉(zhuǎn)錄因子在睪丸中有表達(dá),但在睪丸各類(lèi)細(xì)胞中的表達(dá)情況如何,則報(bào)道很少[7]。本研究從分子水平探討不同能量水平下睪丸中GATA-4 mRNA表達(dá)規(guī)律,并用免疫組化技術(shù)對(duì)睪丸中GATA-4進(jìn)行定位研究,希望能夠?yàn)樘接慓ATA-4在睪丸分化以及通過(guò)調(diào)控激素進(jìn)而調(diào)控動(dòng)物繁殖性能方面提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    1.1.1 主要試劑

    DEPC:Sig ma公司

    RNAiso Plus(Code:D9108A):Ta Ka Ra生物工程公司

    Pri meScript?RT Master(Code:DRR036A):Ta Ka Ra生物工程公司

    SYBR?Premix Ex TaqTMII (Code:DRR820 A):Ta Ka Ra生物工程公司

    兔抗性GATA-4一抗:北京博奧森生物技術(shù)有限公司生物素標(biāo)記的鼠抗兔二抗:武漢博士德生物公司即用型SABC免疫組化試劑盒:武漢博士德生物公司

    DAB顯色試劑盒:武漢博士德生物公司

    1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

    選用18只健康的、體重相近的杜泊羊×小尾寒羊未去勢(shì)雜種公羔。在10天的適應(yīng)期后,將18只羔羊隨機(jī)分配到飼喂能量蛋白水平不同的3組中:自 由采食組 (Voluntary feed intake,VFI)、35%VFI組和65%VFI組。其中35%VFI組能量攝入為自由采食組的35%,65%VFI組能量攝入為自由采食組的65%。當(dāng)自由采食組體重達(dá)35 kg時(shí)各組分別屠宰取樣。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 取材及組織處理

    通過(guò)頸靜脈放血致死,取睪丸組織,用預(yù)冷的生理鹽水沖洗表面的脂肪及血漬,DEPC水處理過(guò)的刀片分割成小塊,經(jīng)RNA酶滅活處理的錫箔紙包好快速裝入預(yù)冷的凍存管中。每只另取相同部位睪丸組織,切成0.3 c m×0.5 c m×0.5 c m左右,用4%多聚甲醛在4℃固定24 h,0.01 mol·L-1PBS(p H 7.4)洗3次,進(jìn)行脫水、包埋、5μm厚石蠟切片。

    1.2.2 綿羊睪丸組織總RNA的提取

    參照Ta Ka Ra公司RNAiso Plus實(shí)驗(yàn)操作說(shuō)明進(jìn)行睪丸組織總RNA的提取。

    1.2.3 總RNA濃度的測(cè)定

    通過(guò)Nanodr op-1000核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)純度、濃度及 A260/A280。

    1.2.4 c DNA第一鏈的合成

    使用Pri meScriptTMRT Master中的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄試驗(yàn),反應(yīng)體系(10μL)如下:5×Pri meScriptTMBuff er 2μL,Total RNA 1μL,RNase-Free d H2O 7μL。反轉(zhuǎn)錄程序?yàn)椋?7℃15 min,85℃ 5 s。所得c DNA 用 Nanodr op-1000核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)后可于-20℃保存3個(gè)月。

    1.2.5 Real-time PCR檢測(cè)不同能量水平下睪丸組織中GATA-4的表達(dá)

    1.2.5.1 引物的設(shè)計(jì)及合成

    本研究Real-time PCR以18S r RNA為內(nèi)參基因,參考Gen Bank上已登錄的牛的GATA-4(NM_001192877)的 mRNA 序列,利用 Pri mer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)合成兩對(duì)特異性引物,由北京六合華大基因科技股份有限公司合成,引物序列信息見(jiàn)表1。

    表1 熒光定量PCR所用引物序列Table 1 Pri mer sequences of quantitative PCR

    1.2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制及定量分析

    將c DNA 5×稀釋8個(gè)梯度后進(jìn)行熒光定量反應(yīng),軟件自動(dòng)得出目的基因GATA-4與內(nèi)參基因18S r RNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程、擴(kuò)增效率R2及線(xiàn)性方程系數(shù)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)自動(dòng)計(jì)算出每個(gè)樣本中每微升18S r RNA和GATA-4的拷貝數(shù)。以?xún)?nèi)參基因18S r RNA的表達(dá)量將所測(cè)定的所有組織樣品的GATA-4 mRNA的表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化,得出對(duì)應(yīng)的各個(gè)能量水平下的相對(duì)表達(dá)量。

    1.2.5.3 Real-time PCR反應(yīng)

    根據(jù)SYBR?Premix Ex TaqTMII試劑盒(表1)建議的反應(yīng)體系及優(yōu)化確定的反應(yīng)條件,進(jìn)行內(nèi)參基因和目的基因的相對(duì)定量分析。不同組織重復(fù)試驗(yàn)6只公羊,每種組織另設(shè)技術(shù)重復(fù)3次,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)以及熔解曲線(xiàn)CT值計(jì)算定量結(jié)果。反應(yīng)體系(10μL)如下:SYBR Premix Ex Taq II(2×)5μL、上下游引物各0.25μL,c DNA溶液1 μL,dd H2O 3.3μL,ROX Reference Dye II 0.2 μL。擴(kuò)增條件為:95℃30 s,(95℃30 s,63℃35 s)60 Cycles,95℃15 s、63℃1 min、95℃15 s。

    1.2.6 睪丸組織免疫組化染色

    切片經(jīng)二甲苯及梯度酒精脫蠟;3%H2O2封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性,室溫10 min;水洗3 min×2次;加復(fù)合消化液抗原修復(fù)37℃,30 min;PBS洗3 min×3次;5%BSA封閉液室溫封閉30 min;去除多余液體,滴加1∶300稀釋Rabbit Anti-GATA-4多克隆一抗,濕盒內(nèi)4℃過(guò)夜;PBS洗5 min×3次;加生物素標(biāo)記二抗37℃,30 min;PBS洗5 min×3次;DAB顯色10 min,蒸餾水沖洗2~3次終止顯色;蘇木精復(fù)染1 min,0.5%HCl酒精洗1 min;自來(lái)水沖洗2 min,脫水,二甲苯透明,中性樹(shù)膠封片。同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照,用PBS代替一抗,其余步驟同上,確定免疫反應(yīng)的特異性。

    1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    采用SPSS13.0軟件進(jìn)行完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料單因素方差分析和顯著性檢驗(yàn)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 總RNA質(zhì)量控制及RT-PCR檢測(cè)

    所提取睪丸總RNA純度 A260/A280均介于1.8~2.0,表明所提取的RNA質(zhì)量可靠,符合反轉(zhuǎn)錄要求。并且以RT-PCR反應(yīng)的產(chǎn)物c DNA為模板進(jìn)行內(nèi)參基因和目的基因的PCR反應(yīng),通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳均可檢測(cè)到擴(kuò)增結(jié)果,表明反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可用于后續(xù)目的基因的定量PCR。

    2.2 定量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立

    圖1A、B分別為相對(duì)濃度57、56、55、54、53和52拷貝的18S r RNA和GATA-4 Real-time PCR擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)。目的基因和內(nèi)參基因基線(xiàn)平穩(wěn),拐點(diǎn)清楚,平行性較好;圖1 C顯示擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線(xiàn)只有單一的峰,無(wú)非特異性產(chǎn)物和引物二聚體;圖1 D為軟件自動(dòng)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),在6個(gè)濃度梯度上呈良好的線(xiàn)性關(guān)系,擴(kuò)增效率在100%~110%,回歸系數(shù)分別為0.997和0.998,說(shuō)明本研究建立的GATA-4和18S r RNA定量檢測(cè)方法有效。

    圖1 GATA-4與18S r RNA基因擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)及樣品熔解曲線(xiàn)Fig.1 PCR amplification plots,standard curves and dissociation curves for GATA-4 and 18Sr RNA

    2.3 不同能量水平下GATA-4 mRNA的表達(dá)差異

    由圖2可以看出,經(jīng)過(guò)內(nèi)參18Sr RNA對(duì)綿羊睪丸GATA-4表達(dá)量的校正,GATA-4在自由采食組的表達(dá)量最多,其他能量水平與其相比差異極顯著(P<0.01),順序依次為:35%VFI組<65%VFI組<自由采食組(VFI)。

    2.4 GATA-4在不同能量水平下睪丸中的表達(dá)特點(diǎn)

    鑒于GATA-4 mRNA在不同能量水平下睪丸中表達(dá)水平不同,采用免疫組化技術(shù)對(duì)GATA-4進(jìn)行定位研究。結(jié)果顯示,GATA-4免疫反應(yīng)產(chǎn)物在35%VFI、65%VFI、自由采食3個(gè)能量水平綿羊睪丸組織中均有分布,且在各級(jí)生精細(xì)胞、Sertoli細(xì)胞和Leydig細(xì)胞均有表達(dá),而陰性對(duì)照DAB染色結(jié)果則無(wú)明顯表達(dá)產(chǎn)物(圖3)。

    圖2 不同能量水平下綿羊睪丸中GATA-4 mRNA相對(duì)表達(dá)量Fig.2 Relative GATA-4 mRNA expression in the testes of sheep at different energy levels

    圖3 綿羊睪丸組織GATA-4表達(dá)結(jié)果(免疫組化×400)Fig.3 Expressions of GATA-4 in the testis of different groups of sheep(immunoh is tochemistry×400)

    從圖3可看出,在35%VFI能量水平下,GATA-4主要表達(dá)于Sertoli細(xì)胞中,在Leydig細(xì)胞和生精細(xì)胞中有少量表達(dá),且精子的形成量明顯少于65%VFI和自由采食能量水平。GATA-4在自由采食組個(gè)體的Leydig細(xì)胞和Sertoli細(xì)胞中表達(dá)較多,但更多地表達(dá)于生精細(xì)胞。自由采食組中,GATA-4表達(dá)陽(yáng)性的生精細(xì)胞率以及精子量也明顯高于65%VFI能量水平(表2)。

    表2 不同能量水平下小鼠睪丸組織中GATA-4的陽(yáng)性細(xì)胞率Table 2 Percentage of positive cells for GATA-4 expression in the testes of sheep at different energy levels

    3 結(jié)論與討論

    GATA家族在哺乳動(dòng)物卵巢和睪丸的多種細(xì)胞中均有表達(dá),對(duì)生殖系統(tǒng)的發(fā)育具有重要意義,可調(diào)控動(dòng)物的性別決定和生殖功能。GATA-4在豬的性別分化到性成熟的各個(gè)時(shí)期均有表達(dá),從睪丸分化到成熟階段,也檢測(cè)到Sertoli細(xì)胞和Leydig細(xì)胞存在GATA-4 mRNA。研究結(jié)果表明,GATA-4轉(zhuǎn)錄因子能通過(guò)與SF-I轉(zhuǎn)錄因子的相互作用轉(zhuǎn)錄激活繆勒氏抑制素,從而導(dǎo)致繆勒氏導(dǎo)管的單向退化和中腎導(dǎo)管系統(tǒng)的發(fā)育增強(qiáng),進(jìn)而影響性別分化[8,9]。進(jìn)一步的研究證明,轉(zhuǎn)錄因子GATA-4和GATA-6在哺乳動(dòng)物性腺細(xì)胞系的分化和生殖過(guò)程中各激素的調(diào)節(jié)上都有著不可或缺的作用[10]。

    動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)狀況與其生產(chǎn)、繁殖密切相關(guān)。能量是哺乳動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)的基礎(chǔ),也是生殖細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育和合成生殖激素的物質(zhì)基礎(chǔ)[11]。不同能量水平下GATA-4 mRNA在綿羊睪丸組織中均有表達(dá),但表達(dá)量存在差異,這與能量攝入量是密切相關(guān)的,說(shuō)明能量水平影響GATA-4 mRNA的表達(dá)量。能量水平同樣會(huì)影響哺乳動(dòng)物促性腺激素釋放激素(Gn RH)的脈沖產(chǎn)生系統(tǒng)及性腺素的釋放。景彩霞等認(rèn)為,促性腺激素可以上調(diào)GATA-4的表達(dá)[12],在睪丸Sertoli細(xì)胞和Leydig細(xì)胞的增殖旺盛時(shí)期表達(dá)增強(qiáng)。GATA-4因子可正向調(diào)控性腺軸激素的表達(dá)量,其大量結(jié)合會(huì)提高Gn RH的分泌量,進(jìn)而直接影響FSH和L H等激素的分泌,且GATA-4參與FSH到Gn RH的反饋調(diào)節(jié)路徑。這說(shuō)明GATA-4的表達(dá)與性腺軸激素的分泌和表達(dá)存在著相互調(diào)控的關(guān)系,但是其調(diào)控機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

    精子的成熟離不開(kāi)GATA-4對(duì)Sertoli細(xì)胞和Leydig細(xì)胞的調(diào)控[13]。GATA-4通過(guò)調(diào)控Sertoli細(xì)胞及Leydig細(xì)胞來(lái)促進(jìn)精子成熟,還可直接作用于生精細(xì)胞來(lái)促進(jìn)精子的形成。通過(guò)免疫組化技術(shù)定位GATA-4在睪丸組織中的表達(dá),發(fā)現(xiàn)GATA-4在35%VFI組睪丸組織生精細(xì)胞的表達(dá)量明顯少于65%VFI組和自由采食組,且精子的形成量也明顯少于65%VFI組和自由采食組,順序由小到大依次為:35%VFI組<65%VFI組<自由采食組,可見(jiàn)GATA-4的表達(dá)量與生精細(xì)胞的增殖和精子的形成有著密切聯(lián)系。直觀驗(yàn)證了GATA-4 mRNA在睪丸中表達(dá)存在差異的結(jié)果,故推測(cè)睪丸組織中GATA-4 mRNA表達(dá)差異是由能量攝入量不同造成的,其調(diào)控機(jī)制有待于進(jìn)一步探索。

    [1]El-Hachem N,Nemer G.Identification of new GATA4-small molecule inhibitors by structure-based virtual screening[J].Bioorganic and Medicinal Chemistry,2011,19:1734-1742.

    [2]Huang W Y,Heng H H,Liew C C.Assign ment of the hu man GATA4 gene to 8p23.1→p22 using fl uorescence in situ hybridization analysis[J].Cytogenet Cell Genet,1996,72(2-3):217-218.

    [3]宮立國(guó),邱廣蓉,徐小延,等.心臟特異轉(zhuǎn)錄因子NK X2-5、TBX5、GATA4與先天性心臟病的研究進(jìn)展[J].國(guó)際遺傳學(xué)雜志,2006,29(2):133-136.

    [4]Yuichir o J,Suzuki.Cell signaling pat h ways for the regulation of GATA-4 transcription factor:Implications for cell growt h and apoptosis[J].Cell ular Signalling,2011,23:1094-1099.

    [5]何遠(yuǎn)清,儲(chǔ)明星,劉榮志,等.GATA 家族與哺乳動(dòng)物繁殖[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī),2007,34(11):42-45.

    [6]Bielinska M,Seehra A,Toppari J,etal.GATA-4 is required for sex ster oidogenic cell develop ment in the fetal mouse[J].Develop mental Dyna mics,2007,236:203-213.

    [7]楊加周,趙豫鳳,王艷梅,等.GATA-4在小鼠睪丸中的表達(dá)定位研究[J].中華男科學(xué)雜志,2010,16(10):901-904.

    [8]Ketola I,Rah man N,Toppari J,etal.Expression and regulation of transcription factors GATA-4 and GATA-6 in developing mouse testis[J].Endocrinology,1999,140(3):1470-1480.

    [9]Tremblay J J,Robert N M,Viger R S.Modulation of endogenous GATA-4 activity reveals its dual contribution to Mulleran inhibiting substance gene transcription in Sertoli cells[J].Molecular Endocrinology,2001,15(9):1636-1650.

    [10]La Voie HA.The role of GATA in ma mmalian repr oduction[J].Experi mental biology and medicine(May wood,N.J.),2003,228(11):1282-1290.

    [11]巫亮.灘羊母羊日糧中能量和蛋白質(zhì)水平對(duì)其繁殖性能影響的研究[D].寧夏大學(xué)碩士學(xué)位論文,2010.

    [12]景彩霞,楊加周,艾慶燕,等.GATA 家族與生殖[J].中華男科學(xué)雜志,2009,15(10):932-936.

    [13]Bielinska M,Seehra A,Toppari J,etal.GATA-4 is required for sex steroidogenic cell develop ment in the fetal mouse[J].Developmental Dynamics,2007,236(1):203-213.

    猜你喜歡
    生精睪丸免疫組化
    超聲診斷睪丸腎上腺殘余瘤1例并文獻(xiàn)復(fù)習(xí)
    夏枯草水提液對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性甲狀腺炎的治療作用及機(jī)制研究
    嬰幼兒原始黏液樣間葉性腫瘤一例及文獻(xiàn)復(fù)習(xí)
    結(jié)直腸癌組織中SOX9與RUNX1表達(dá)及其臨床意義
    睪丸“犯擰”,趕快就醫(yī)
    精杞膠囊對(duì)大鼠生精功能損傷的保護(hù)作用
    中成藥(2017年4期)2017-05-17 06:09:20
    生精細(xì)胞發(fā)育相關(guān)lncRNA的研究進(jìn)展
    子宮瘢痕妊娠的病理免疫組化特點(diǎn)分析
    高脂飲食誘導(dǎo)大鼠生精功能障礙
    補(bǔ)腎利濕生精方治療少精或弱精癥的效果觀察
    日本黄大片高清| 狂野欧美激情性xxxx| 啪啪无遮挡十八禁网站| 91在线精品国自产拍蜜月 | 亚洲欧美日韩无卡精品| 精品久久久久久久毛片微露脸| 美女cb高潮喷水在线观看 | 十八禁网站免费在线| 老鸭窝网址在线观看| 婷婷丁香在线五月| 国产毛片a区久久久久| 午夜福利在线在线| 国产精品女同一区二区软件 | 久久这里只有精品中国| 亚洲精华国产精华精| 最新在线观看一区二区三区| 丁香六月欧美| 此物有八面人人有两片| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 亚洲成av人片免费观看| 脱女人内裤的视频| 男人舔女人的私密视频| 成在线人永久免费视频| aaaaa片日本免费| 亚洲 欧美一区二区三区| 精品国产亚洲在线| 亚洲熟妇熟女久久| 免费在线观看亚洲国产| 国产亚洲精品av在线| 精品电影一区二区在线| 舔av片在线| bbb黄色大片| 国产探花在线观看一区二区| 18禁观看日本| 国产精品av久久久久免费| 精品无人区乱码1区二区| 免费在线观看日本一区| 国产精品综合久久久久久久免费| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 精品熟女少妇八av免费久了| 国产激情偷乱视频一区二区| av中文乱码字幕在线| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| bbb黄色大片| 波多野结衣巨乳人妻| 国产爱豆传媒在线观看| 国产精品爽爽va在线观看网站| 久9热在线精品视频| 一级毛片女人18水好多| 日韩欧美国产一区二区入口| 精品久久久久久久毛片微露脸| 三级毛片av免费| 免费一级毛片在线播放高清视频| 成人国产一区最新在线观看| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 色av中文字幕| 在线观看免费视频日本深夜| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 午夜激情福利司机影院| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| avwww免费| 91久久精品国产一区二区成人 | 怎么达到女性高潮| 久久久久国产一级毛片高清牌| 看黄色毛片网站| 又粗又爽又猛毛片免费看| 国产精品日韩av在线免费观看| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 国产精品亚洲av一区麻豆| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 午夜免费激情av| 久久热在线av| 999精品在线视频| 亚洲av成人av| 国产视频内射| 又黄又爽又免费观看的视频| 国产91精品成人一区二区三区| 又大又爽又粗| 中文字幕久久专区| 国产av在哪里看| 叶爱在线成人免费视频播放| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 999精品在线视频| 成年女人永久免费观看视频| 国产69精品久久久久777片 | 欧美日韩福利视频一区二区| 国产亚洲精品一区二区www| 亚洲美女黄片视频| 欧美在线一区亚洲| 久久伊人香网站| 全区人妻精品视频| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 精品熟女少妇八av免费久了| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 最新中文字幕久久久久 | 搞女人的毛片| 亚洲激情在线av| 久久性视频一级片| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 美女免费视频网站| 男插女下体视频免费在线播放| xxx96com| 国产精品影院久久| 最近最新中文字幕大全免费视频| 观看免费一级毛片| 波多野结衣高清无吗| 香蕉丝袜av| 特大巨黑吊av在线直播| 一级黄色大片毛片| 久久久国产精品麻豆| x7x7x7水蜜桃| 国语自产精品视频在线第100页| 99re在线观看精品视频| 久久久久久久久久黄片| av中文乱码字幕在线| 亚洲午夜理论影院| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 午夜免费激情av| 午夜激情欧美在线| 国产在线精品亚洲第一网站| 国产亚洲精品av在线| 在线a可以看的网站| 日韩精品青青久久久久久| 一a级毛片在线观看| 中文字幕熟女人妻在线| 午夜免费激情av| 精品日产1卡2卡| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 婷婷精品国产亚洲av在线| 亚洲,欧美精品.| 两个人视频免费观看高清| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 国产高清三级在线| 一个人看的www免费观看视频| 午夜影院日韩av| 极品教师在线免费播放| 久久久色成人| 日韩精品中文字幕看吧| 日韩三级视频一区二区三区| 99久久综合精品五月天人人| 国产亚洲av高清不卡| 久久精品影院6| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 一个人看视频在线观看www免费 | 亚洲欧美一区二区三区黑人| 中文在线观看免费www的网站| 老熟妇仑乱视频hdxx| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 久久久久国内视频| 亚洲午夜理论影院| 丰满人妻一区二区三区视频av | 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 桃色一区二区三区在线观看| 日韩中文字幕欧美一区二区| 91av网站免费观看| 淫妇啪啪啪对白视频| 日韩精品青青久久久久久| 岛国在线免费视频观看| 一级毛片精品| 日本 av在线| 亚洲成av人片免费观看| 欧美精品啪啪一区二区三区| 国产av不卡久久| 夜夜夜夜夜久久久久| 婷婷精品国产亚洲av| 久久精品影院6| 国产成人欧美在线观看| av在线蜜桃| 国产精品精品国产色婷婷| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 小说图片视频综合网站| 日韩欧美免费精品| 高潮久久久久久久久久久不卡| 神马国产精品三级电影在线观看| 99国产精品一区二区蜜桃av| 人人妻人人看人人澡| 午夜福利欧美成人| 女警被强在线播放| 在线观看66精品国产| 久久久久久久午夜电影| 久久国产精品人妻蜜桃| 搡老岳熟女国产| 久久性视频一级片| 成人国产综合亚洲| 99热只有精品国产| 99久久综合精品五月天人人| 亚洲 国产 在线| av视频在线观看入口| 国内精品久久久久精免费| 国产极品精品免费视频能看的| 日韩欧美精品v在线| 亚洲五月天丁香| 成人欧美大片| 五月伊人婷婷丁香| 99久久国产精品久久久| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 制服丝袜大香蕉在线| 99热这里只有是精品50| 国产av在哪里看| 亚洲国产欧美人成| 又爽又黄无遮挡网站| 国产伦一二天堂av在线观看| 啦啦啦免费观看视频1| 成年人黄色毛片网站| 成人永久免费在线观看视频| 国产欧美日韩精品亚洲av| 欧美中文日本在线观看视频| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 母亲3免费完整高清在线观看| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 日韩欧美精品v在线| 两性夫妻黄色片| 国产精品99久久久久久久久| 国产精品,欧美在线| 亚洲成a人片在线一区二区| 国产精品亚洲一级av第二区| 国产成人精品久久二区二区91| 国内精品久久久久精免费| 美女午夜性视频免费| 欧美日韩福利视频一区二区| 亚洲中文字幕日韩| 成人午夜高清在线视频| 黑人操中国人逼视频| 91麻豆精品激情在线观看国产| e午夜精品久久久久久久| 亚洲成人免费电影在线观看| 啪啪无遮挡十八禁网站| 超碰成人久久| 午夜福利免费观看在线| 天堂影院成人在线观看| 国产真人三级小视频在线观看| 精品欧美国产一区二区三| 搞女人的毛片| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 婷婷丁香在线五月| 色老头精品视频在线观看| 精品国产亚洲在线| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 欧美在线黄色| 日韩欧美免费精品| 久久草成人影院| 成年版毛片免费区| 久久久水蜜桃国产精品网| 成年免费大片在线观看| 婷婷亚洲欧美| 亚洲18禁久久av| 无人区码免费观看不卡| 色老头精品视频在线观看| АⅤ资源中文在线天堂| www国产在线视频色| 亚洲电影在线观看av| 精品国产乱码久久久久久男人| 亚洲第一电影网av| 老汉色∧v一级毛片| 国产精品女同一区二区软件 | 亚洲专区字幕在线| 国产主播在线观看一区二区| 国产亚洲av嫩草精品影院| 淫妇啪啪啪对白视频| 成人av一区二区三区在线看| 淫秽高清视频在线观看| 首页视频小说图片口味搜索| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 亚洲真实伦在线观看| 欧美激情在线99| 色尼玛亚洲综合影院| 国产亚洲av高清不卡| 久久精品影院6| 国内精品久久久久久久电影| 国产熟女xx| 欧美av亚洲av综合av国产av| 日本 欧美在线| 高潮久久久久久久久久久不卡| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 免费观看人在逋| 午夜成年电影在线免费观看| 亚洲中文字幕日韩| 极品教师在线免费播放| 亚洲欧美精品综合久久99| 亚洲中文字幕日韩| 国产午夜精品久久久久久| 99精品欧美一区二区三区四区| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 久久国产精品人妻蜜桃| av天堂在线播放| 中亚洲国语对白在线视频| 亚洲精品乱码久久久v下载方式 | 日本黄色视频三级网站网址| 香蕉丝袜av| 淫妇啪啪啪对白视频| 村上凉子中文字幕在线| 色精品久久人妻99蜜桃| 国产综合懂色| 身体一侧抽搐| 久久精品综合一区二区三区| 国产精品亚洲av一区麻豆| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 久久久久久久久久黄片| 无人区码免费观看不卡| 日韩精品中文字幕看吧| 日韩欧美三级三区| 美女 人体艺术 gogo| 日本熟妇午夜| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 久久这里只有精品19| 国产毛片a区久久久久| 国产私拍福利视频在线观看| 熟女人妻精品中文字幕| 特级一级黄色大片| 91麻豆精品激情在线观看国产| 亚洲成人久久爱视频| 特级一级黄色大片| 午夜亚洲福利在线播放| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 久久久国产精品麻豆| 亚洲在线自拍视频| 欧美黄色片欧美黄色片| 亚洲在线自拍视频| 久久精品影院6| 亚洲人成网站高清观看| 在线免费观看的www视频| 午夜成年电影在线免费观看| 久久99热这里只有精品18| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 日韩成人在线观看一区二区三区| 国产69精品久久久久777片 | 一本精品99久久精品77| 精品国产美女av久久久久小说| 亚洲男人的天堂狠狠| 欧美av亚洲av综合av国产av| 99久国产av精品| 在线视频色国产色| 国产v大片淫在线免费观看| 亚洲自拍偷在线| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 久久精品人妻少妇| 老司机午夜十八禁免费视频| av天堂在线播放| x7x7x7水蜜桃| 午夜福利18| 精品日产1卡2卡| 91av网一区二区| 夜夜夜夜夜久久久久| av中文乱码字幕在线| 精品无人区乱码1区二区| 亚洲 国产 在线| 一进一出抽搐动态| 男人舔奶头视频| 欧美日韩一级在线毛片| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 欧美色视频一区免费| 一级黄色大片毛片| 禁无遮挡网站| 国产高潮美女av| 久久亚洲真实| 亚洲av成人一区二区三| 综合色av麻豆| 色综合婷婷激情| 色综合亚洲欧美另类图片| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 成人特级黄色片久久久久久久| 黄频高清免费视频| 一级毛片女人18水好多| 男女下面进入的视频免费午夜| 真人一进一出gif抽搐免费| 精品福利观看| 叶爱在线成人免费视频播放| 国产探花在线观看一区二区| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 老司机午夜十八禁免费视频| 国产一区二区三区视频了| 母亲3免费完整高清在线观看| 国产免费男女视频| 亚洲国产欧美人成| 中文在线观看免费www的网站| 啦啦啦免费观看视频1| 亚洲成人久久爱视频| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 欧美成人性av电影在线观看| 99国产精品99久久久久| 亚洲av免费在线观看| 夜夜夜夜夜久久久久| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 丝袜人妻中文字幕| 白带黄色成豆腐渣| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 久久久久久久久免费视频了| 亚洲片人在线观看| 少妇的丰满在线观看| 亚洲 国产 在线| 亚洲欧美日韩高清专用| 熟女电影av网| 男女视频在线观看网站免费| 又黄又粗又硬又大视频| 久久久水蜜桃国产精品网| 亚洲在线观看片| 亚洲自拍偷在线| 亚洲人成电影免费在线| 99国产精品一区二区三区| 国产欧美日韩精品亚洲av| 熟女人妻精品中文字幕| 欧美成人性av电影在线观看| 欧美成狂野欧美在线观看| 国产伦在线观看视频一区| 亚洲精品色激情综合| 国产激情久久老熟女| 成人三级黄色视频| 少妇的丰满在线观看| 日韩欧美国产一区二区入口| 国产美女午夜福利| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 国模一区二区三区四区视频 | 波多野结衣高清作品| 国产在线精品亚洲第一网站| 丰满的人妻完整版| svipshipincom国产片| 国产乱人视频| 美女 人体艺术 gogo| 老熟妇仑乱视频hdxx| 一本久久中文字幕| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 国产精品久久视频播放| 国语自产精品视频在线第100页| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 国产熟女xx| 成在线人永久免费视频| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 中文字幕熟女人妻在线| 中文字幕高清在线视频| 国产精品日韩av在线免费观看| 窝窝影院91人妻| 免费av毛片视频| 国产av一区在线观看免费| 日韩成人在线观看一区二区三区| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 亚洲电影在线观看av| 国产成人影院久久av| 在线观看免费视频日本深夜| 两个人视频免费观看高清| 国产伦在线观看视频一区| 亚洲,欧美精品.| 美女扒开内裤让男人捅视频| 国产野战对白在线观看| 99国产精品一区二区蜜桃av| 午夜福利在线观看吧| 搞女人的毛片| 九九热线精品视视频播放| 日韩大尺度精品在线看网址| 久久中文看片网| 午夜福利成人在线免费观看| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 99精品久久久久人妻精品| 在线a可以看的网站| 最近最新中文字幕大全免费视频| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 国产一区二区激情短视频| 精品久久久久久久久久久久久| 亚洲国产看品久久| 国产亚洲欧美98| 久久久久亚洲av毛片大全| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 国产亚洲av高清不卡| 欧美乱码精品一区二区三区| 国产精品,欧美在线| www.精华液| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 国产精品 欧美亚洲| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 婷婷丁香在线五月| 国产私拍福利视频在线观看| 国产激情欧美一区二区| 亚洲无线在线观看| 亚洲国产精品合色在线| 桃红色精品国产亚洲av| 97碰自拍视频| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 五月玫瑰六月丁香| 国产成人精品久久二区二区免费| 亚洲黑人精品在线| 亚洲成人久久性| 国产亚洲欧美98| 色综合亚洲欧美另类图片| 免费观看精品视频网站| 亚洲av第一区精品v没综合| 国产精品久久久久久久电影 | 亚洲av第一区精品v没综合| 熟女电影av网| aaaaa片日本免费| 国产精品av视频在线免费观看| 免费在线观看日本一区| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 一个人看视频在线观看www免费 | 99热这里只有是精品50| 成在线人永久免费视频| www日本在线高清视频| 天天躁日日操中文字幕| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 长腿黑丝高跟| 国产熟女xx| 久久这里只有精品中国| 淫妇啪啪啪对白视频| 中文字幕熟女人妻在线| 小说图片视频综合网站| 国产亚洲欧美98| 一进一出好大好爽视频| 一区二区三区国产精品乱码| 日韩av在线大香蕉| 老熟妇仑乱视频hdxx| 精品午夜福利视频在线观看一区| 美女黄网站色视频| 麻豆一二三区av精品| 两个人视频免费观看高清| 国产亚洲av高清不卡| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 最新中文字幕久久久久 | 18禁国产床啪视频网站| 欧美乱码精品一区二区三区| 久久久久九九精品影院| 午夜福利18| 久久热在线av| 欧美日韩乱码在线| 欧美日韩黄片免| 美女高潮的动态| 欧美午夜高清在线| 欧美高清成人免费视频www| 亚洲精华国产精华精| ponron亚洲| 亚洲国产中文字幕在线视频| 亚洲国产欧美人成| 免费av不卡在线播放| 亚洲成人久久爱视频| 热99在线观看视频| 人人妻人人看人人澡| 午夜福利在线观看吧| 国产精品影院久久| 国产综合懂色| 制服丝袜大香蕉在线| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 一二三四在线观看免费中文在| 欧美成狂野欧美在线观看| 美女大奶头视频| 91老司机精品| 搡老妇女老女人老熟妇| 亚洲成人久久性| 99热这里只有精品一区 | 最新美女视频免费是黄的| 叶爱在线成人免费视频播放| 国产极品精品免费视频能看的| 亚洲精品456在线播放app | 亚洲专区字幕在线| 一本一本综合久久| 国产一区二区在线观看日韩 | 成人永久免费在线观看视频| 亚洲成av人片免费观看| 国产一区二区在线观看日韩 | 亚洲av五月六月丁香网| 在线观看免费午夜福利视频| av欧美777| 国产成人精品久久二区二区免费| 亚洲五月天丁香| av中文乱码字幕在线| 两个人看的免费小视频| 两个人视频免费观看高清| 日本免费一区二区三区高清不卡| 欧美中文综合在线视频| 中文字幕熟女人妻在线| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 婷婷丁香在线五月| 色综合站精品国产| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 成年免费大片在线观看| 波多野结衣高清作品| 白带黄色成豆腐渣| 久久久久性生活片| 最新中文字幕久久久久 | АⅤ资源中文在线天堂| 国产精品一区二区精品视频观看| 在线免费观看不下载黄p国产 | 99国产精品99久久久久| a在线观看视频网站| 村上凉子中文字幕在线| 精品国内亚洲2022精品成人| 亚洲国产精品成人综合色| 1000部很黄的大片| 特大巨黑吊av在线直播| 淫秽高清视频在线观看| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 成人亚洲精品av一区二区| 淫秽高清视频在线观看| 亚洲精品在线美女| 国产精品久久电影中文字幕| 淫秽高清视频在线观看| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 成年女人看的毛片在线观看| 狂野欧美激情性xxxx| 亚洲熟妇熟女久久| 精品不卡国产一区二区三区| 精品久久蜜臀av无| 亚洲国产欧美人成| 日韩中文字幕欧美一区二区| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 国产成人福利小说| 九九在线视频观看精品| 欧美成人免费av一区二区三区| 一个人免费在线观看的高清视频| 亚洲中文字幕日韩| 校园春色视频在线观看| 成在线人永久免费视频| 12—13女人毛片做爰片一| 色尼玛亚洲综合影院| 国产精品女同一区二区软件 | 精品久久蜜臀av无|