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    GATA-4在不同能量水平下綿羊睪丸中的表達(dá)與定位分析

    2012-10-26 11:08:34楊慧妮武曉英張春香任有蛇岳文斌
    關(guān)鍵詞:生精睪丸免疫組化

    楊慧妮,武曉英,2,張春香,任有蛇,岳文斌

    (1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院,山西 太谷030801;2.太原師范學(xué)院 生物系,山西 太原030006)

    轉(zhuǎn)錄因子GATA-4是具有鋅指結(jié)構(gòu)的GATA家族中的第四個(gè)成員。該家族轉(zhuǎn)錄因子具有與特定DNA結(jié)合的鋅指結(jié)構(gòu)域,在進(jìn)化過(guò)程中高度保守[1]。1996年 Huang等[2]應(yīng)用原位雜交技術(shù)將人的GATA-4定位于8p23.1→p22,c DNA 全長(zhǎng)3372 bp,有6個(gè)外顯子,編碼442個(gè)氨基酸。GATA-4在中胚層和內(nèi)胚層起源的組織中廣泛表達(dá)(如心臟、睪丸和卵巢等)。最初發(fā)現(xiàn)GATA-4可以調(diào)控心臟發(fā)育,隨后證明它是成年心臟肥大的一個(gè)重要調(diào)控因子。GATA-4調(diào)控多種基因的表達(dá),其調(diào)控作用在心臟、生殖系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和癌癥中均占有重要地位。因此GATA-4的正反調(diào)控是其生物功能的重要組分[3]。

    在過(guò)去十年中,大量研究了轉(zhuǎn)錄因子GATA在人類(lèi)疾病中的作用[4]。目前GATA-4已成為研究的焦點(diǎn),表明其在雄性性別決定、類(lèi)固醇激素合成和細(xì)胞存活上有重要作用。尤其是在哺乳動(dòng)物的繁殖有多個(gè)途徑的調(diào)控上,可能有著決定性作用[5]。國(guó)外研究表明,GATA-4轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)于Sertoli細(xì)胞,類(lèi)固醇合成的睪丸Leydig細(xì)胞和其他睪丸體細(xì)胞[6],這說(shuō)明GATA-4轉(zhuǎn)錄因子在睪丸中有表達(dá),但在睪丸各類(lèi)細(xì)胞中的表達(dá)情況如何,則報(bào)道很少[7]。本研究從分子水平探討不同能量水平下睪丸中GATA-4 mRNA表達(dá)規(guī)律,并用免疫組化技術(shù)對(duì)睪丸中GATA-4進(jìn)行定位研究,希望能夠?yàn)樘接慓ATA-4在睪丸分化以及通過(guò)調(diào)控激素進(jìn)而調(diào)控動(dòng)物繁殖性能方面提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    1.1.1 主要試劑

    DEPC:Sig ma公司

    RNAiso Plus(Code:D9108A):Ta Ka Ra生物工程公司

    Pri meScript?RT Master(Code:DRR036A):Ta Ka Ra生物工程公司

    SYBR?Premix Ex TaqTMII (Code:DRR820 A):Ta Ka Ra生物工程公司

    兔抗性GATA-4一抗:北京博奧森生物技術(shù)有限公司生物素標(biāo)記的鼠抗兔二抗:武漢博士德生物公司即用型SABC免疫組化試劑盒:武漢博士德生物公司

    DAB顯色試劑盒:武漢博士德生物公司

    1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

    選用18只健康的、體重相近的杜泊羊×小尾寒羊未去勢(shì)雜種公羔。在10天的適應(yīng)期后,將18只羔羊隨機(jī)分配到飼喂能量蛋白水平不同的3組中:自 由采食組 (Voluntary feed intake,VFI)、35%VFI組和65%VFI組。其中35%VFI組能量攝入為自由采食組的35%,65%VFI組能量攝入為自由采食組的65%。當(dāng)自由采食組體重達(dá)35 kg時(shí)各組分別屠宰取樣。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 取材及組織處理

    通過(guò)頸靜脈放血致死,取睪丸組織,用預(yù)冷的生理鹽水沖洗表面的脂肪及血漬,DEPC水處理過(guò)的刀片分割成小塊,經(jīng)RNA酶滅活處理的錫箔紙包好快速裝入預(yù)冷的凍存管中。每只另取相同部位睪丸組織,切成0.3 c m×0.5 c m×0.5 c m左右,用4%多聚甲醛在4℃固定24 h,0.01 mol·L-1PBS(p H 7.4)洗3次,進(jìn)行脫水、包埋、5μm厚石蠟切片。

    1.2.2 綿羊睪丸組織總RNA的提取

    參照Ta Ka Ra公司RNAiso Plus實(shí)驗(yàn)操作說(shuō)明進(jìn)行睪丸組織總RNA的提取。

    1.2.3 總RNA濃度的測(cè)定

    通過(guò)Nanodr op-1000核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)純度、濃度及 A260/A280。

    1.2.4 c DNA第一鏈的合成

    使用Pri meScriptTMRT Master中的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄試驗(yàn),反應(yīng)體系(10μL)如下:5×Pri meScriptTMBuff er 2μL,Total RNA 1μL,RNase-Free d H2O 7μL。反轉(zhuǎn)錄程序?yàn)椋?7℃15 min,85℃ 5 s。所得c DNA 用 Nanodr op-1000核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)后可于-20℃保存3個(gè)月。

    1.2.5 Real-time PCR檢測(cè)不同能量水平下睪丸組織中GATA-4的表達(dá)

    1.2.5.1 引物的設(shè)計(jì)及合成

    本研究Real-time PCR以18S r RNA為內(nèi)參基因,參考Gen Bank上已登錄的牛的GATA-4(NM_001192877)的 mRNA 序列,利用 Pri mer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)合成兩對(duì)特異性引物,由北京六合華大基因科技股份有限公司合成,引物序列信息見(jiàn)表1。

    表1 熒光定量PCR所用引物序列Table 1 Pri mer sequences of quantitative PCR

    1.2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制及定量分析

    將c DNA 5×稀釋8個(gè)梯度后進(jìn)行熒光定量反應(yīng),軟件自動(dòng)得出目的基因GATA-4與內(nèi)參基因18S r RNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程、擴(kuò)增效率R2及線(xiàn)性方程系數(shù)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)自動(dòng)計(jì)算出每個(gè)樣本中每微升18S r RNA和GATA-4的拷貝數(shù)。以?xún)?nèi)參基因18S r RNA的表達(dá)量將所測(cè)定的所有組織樣品的GATA-4 mRNA的表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化,得出對(duì)應(yīng)的各個(gè)能量水平下的相對(duì)表達(dá)量。

    1.2.5.3 Real-time PCR反應(yīng)

    根據(jù)SYBR?Premix Ex TaqTMII試劑盒(表1)建議的反應(yīng)體系及優(yōu)化確定的反應(yīng)條件,進(jìn)行內(nèi)參基因和目的基因的相對(duì)定量分析。不同組織重復(fù)試驗(yàn)6只公羊,每種組織另設(shè)技術(shù)重復(fù)3次,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)以及熔解曲線(xiàn)CT值計(jì)算定量結(jié)果。反應(yīng)體系(10μL)如下:SYBR Premix Ex Taq II(2×)5μL、上下游引物各0.25μL,c DNA溶液1 μL,dd H2O 3.3μL,ROX Reference Dye II 0.2 μL。擴(kuò)增條件為:95℃30 s,(95℃30 s,63℃35 s)60 Cycles,95℃15 s、63℃1 min、95℃15 s。

    1.2.6 睪丸組織免疫組化染色

    切片經(jīng)二甲苯及梯度酒精脫蠟;3%H2O2封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性,室溫10 min;水洗3 min×2次;加復(fù)合消化液抗原修復(fù)37℃,30 min;PBS洗3 min×3次;5%BSA封閉液室溫封閉30 min;去除多余液體,滴加1∶300稀釋Rabbit Anti-GATA-4多克隆一抗,濕盒內(nèi)4℃過(guò)夜;PBS洗5 min×3次;加生物素標(biāo)記二抗37℃,30 min;PBS洗5 min×3次;DAB顯色10 min,蒸餾水沖洗2~3次終止顯色;蘇木精復(fù)染1 min,0.5%HCl酒精洗1 min;自來(lái)水沖洗2 min,脫水,二甲苯透明,中性樹(shù)膠封片。同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照,用PBS代替一抗,其余步驟同上,確定免疫反應(yīng)的特異性。

    1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    采用SPSS13.0軟件進(jìn)行完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料單因素方差分析和顯著性檢驗(yàn)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 總RNA質(zhì)量控制及RT-PCR檢測(cè)

    所提取睪丸總RNA純度 A260/A280均介于1.8~2.0,表明所提取的RNA質(zhì)量可靠,符合反轉(zhuǎn)錄要求。并且以RT-PCR反應(yīng)的產(chǎn)物c DNA為模板進(jìn)行內(nèi)參基因和目的基因的PCR反應(yīng),通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳均可檢測(cè)到擴(kuò)增結(jié)果,表明反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可用于后續(xù)目的基因的定量PCR。

    2.2 定量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立

    圖1A、B分別為相對(duì)濃度57、56、55、54、53和52拷貝的18S r RNA和GATA-4 Real-time PCR擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)。目的基因和內(nèi)參基因基線(xiàn)平穩(wěn),拐點(diǎn)清楚,平行性較好;圖1 C顯示擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線(xiàn)只有單一的峰,無(wú)非特異性產(chǎn)物和引物二聚體;圖1 D為軟件自動(dòng)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),在6個(gè)濃度梯度上呈良好的線(xiàn)性關(guān)系,擴(kuò)增效率在100%~110%,回歸系數(shù)分別為0.997和0.998,說(shuō)明本研究建立的GATA-4和18S r RNA定量檢測(cè)方法有效。

    圖1 GATA-4與18S r RNA基因擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)及樣品熔解曲線(xiàn)Fig.1 PCR amplification plots,standard curves and dissociation curves for GATA-4 and 18Sr RNA

    2.3 不同能量水平下GATA-4 mRNA的表達(dá)差異

    由圖2可以看出,經(jīng)過(guò)內(nèi)參18Sr RNA對(duì)綿羊睪丸GATA-4表達(dá)量的校正,GATA-4在自由采食組的表達(dá)量最多,其他能量水平與其相比差異極顯著(P<0.01),順序依次為:35%VFI組<65%VFI組<自由采食組(VFI)。

    2.4 GATA-4在不同能量水平下睪丸中的表達(dá)特點(diǎn)

    鑒于GATA-4 mRNA在不同能量水平下睪丸中表達(dá)水平不同,采用免疫組化技術(shù)對(duì)GATA-4進(jìn)行定位研究。結(jié)果顯示,GATA-4免疫反應(yīng)產(chǎn)物在35%VFI、65%VFI、自由采食3個(gè)能量水平綿羊睪丸組織中均有分布,且在各級(jí)生精細(xì)胞、Sertoli細(xì)胞和Leydig細(xì)胞均有表達(dá),而陰性對(duì)照DAB染色結(jié)果則無(wú)明顯表達(dá)產(chǎn)物(圖3)。

    圖2 不同能量水平下綿羊睪丸中GATA-4 mRNA相對(duì)表達(dá)量Fig.2 Relative GATA-4 mRNA expression in the testes of sheep at different energy levels

    圖3 綿羊睪丸組織GATA-4表達(dá)結(jié)果(免疫組化×400)Fig.3 Expressions of GATA-4 in the testis of different groups of sheep(immunoh is tochemistry×400)

    從圖3可看出,在35%VFI能量水平下,GATA-4主要表達(dá)于Sertoli細(xì)胞中,在Leydig細(xì)胞和生精細(xì)胞中有少量表達(dá),且精子的形成量明顯少于65%VFI和自由采食能量水平。GATA-4在自由采食組個(gè)體的Leydig細(xì)胞和Sertoli細(xì)胞中表達(dá)較多,但更多地表達(dá)于生精細(xì)胞。自由采食組中,GATA-4表達(dá)陽(yáng)性的生精細(xì)胞率以及精子量也明顯高于65%VFI能量水平(表2)。

    表2 不同能量水平下小鼠睪丸組織中GATA-4的陽(yáng)性細(xì)胞率Table 2 Percentage of positive cells for GATA-4 expression in the testes of sheep at different energy levels

    3 結(jié)論與討論

    GATA家族在哺乳動(dòng)物卵巢和睪丸的多種細(xì)胞中均有表達(dá),對(duì)生殖系統(tǒng)的發(fā)育具有重要意義,可調(diào)控動(dòng)物的性別決定和生殖功能。GATA-4在豬的性別分化到性成熟的各個(gè)時(shí)期均有表達(dá),從睪丸分化到成熟階段,也檢測(cè)到Sertoli細(xì)胞和Leydig細(xì)胞存在GATA-4 mRNA。研究結(jié)果表明,GATA-4轉(zhuǎn)錄因子能通過(guò)與SF-I轉(zhuǎn)錄因子的相互作用轉(zhuǎn)錄激活繆勒氏抑制素,從而導(dǎo)致繆勒氏導(dǎo)管的單向退化和中腎導(dǎo)管系統(tǒng)的發(fā)育增強(qiáng),進(jìn)而影響性別分化[8,9]。進(jìn)一步的研究證明,轉(zhuǎn)錄因子GATA-4和GATA-6在哺乳動(dòng)物性腺細(xì)胞系的分化和生殖過(guò)程中各激素的調(diào)節(jié)上都有著不可或缺的作用[10]。

    動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)狀況與其生產(chǎn)、繁殖密切相關(guān)。能量是哺乳動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)的基礎(chǔ),也是生殖細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育和合成生殖激素的物質(zhì)基礎(chǔ)[11]。不同能量水平下GATA-4 mRNA在綿羊睪丸組織中均有表達(dá),但表達(dá)量存在差異,這與能量攝入量是密切相關(guān)的,說(shuō)明能量水平影響GATA-4 mRNA的表達(dá)量。能量水平同樣會(huì)影響哺乳動(dòng)物促性腺激素釋放激素(Gn RH)的脈沖產(chǎn)生系統(tǒng)及性腺素的釋放。景彩霞等認(rèn)為,促性腺激素可以上調(diào)GATA-4的表達(dá)[12],在睪丸Sertoli細(xì)胞和Leydig細(xì)胞的增殖旺盛時(shí)期表達(dá)增強(qiáng)。GATA-4因子可正向調(diào)控性腺軸激素的表達(dá)量,其大量結(jié)合會(huì)提高Gn RH的分泌量,進(jìn)而直接影響FSH和L H等激素的分泌,且GATA-4參與FSH到Gn RH的反饋調(diào)節(jié)路徑。這說(shuō)明GATA-4的表達(dá)與性腺軸激素的分泌和表達(dá)存在著相互調(diào)控的關(guān)系,但是其調(diào)控機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

    精子的成熟離不開(kāi)GATA-4對(duì)Sertoli細(xì)胞和Leydig細(xì)胞的調(diào)控[13]。GATA-4通過(guò)調(diào)控Sertoli細(xì)胞及Leydig細(xì)胞來(lái)促進(jìn)精子成熟,還可直接作用于生精細(xì)胞來(lái)促進(jìn)精子的形成。通過(guò)免疫組化技術(shù)定位GATA-4在睪丸組織中的表達(dá),發(fā)現(xiàn)GATA-4在35%VFI組睪丸組織生精細(xì)胞的表達(dá)量明顯少于65%VFI組和自由采食組,且精子的形成量也明顯少于65%VFI組和自由采食組,順序由小到大依次為:35%VFI組<65%VFI組<自由采食組,可見(jiàn)GATA-4的表達(dá)量與生精細(xì)胞的增殖和精子的形成有著密切聯(lián)系。直觀驗(yàn)證了GATA-4 mRNA在睪丸中表達(dá)存在差異的結(jié)果,故推測(cè)睪丸組織中GATA-4 mRNA表達(dá)差異是由能量攝入量不同造成的,其調(diào)控機(jī)制有待于進(jìn)一步探索。

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