建鯉急性肝損傷模型的建立及當(dāng)歸提取物的保肝和抗氧化作用研究

曹麗萍，賈睿，丁煒東，杜金梁，殷國(guó)俊

(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心農(nóng)業(yè)部水生動(dòng)物遺傳育種和養(yǎng)殖生物學(xué)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214081)

肝臟是魚(yú)體內(nèi)最大的實(shí)質(zhì)性器官，參與消化、代謝、排泄、解毒及免疫等多種生命活動(dòng)，特別是胃腸吸收的物質(zhì)幾乎全部進(jìn)入肝臟，在肝臟內(nèi)進(jìn)行合成、分解、轉(zhuǎn)化和貯存，因此，魚(yú)類肝臟最易受多種病原體、毒物及免疫病理所累及［1-2］;同時(shí)環(huán)境污染，高蛋白、高脂肪或霉變飼料的使用，以及抗生素和殺蟲(chóng)劑的濫用均可導(dǎo)致魚(yú)類肝膽疾病頻繁發(fā)生［3］。大量研究證實(shí)，在多種肝病的肝細(xì)胞損傷中，多種酶、自由基以及脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)均發(fā)生較大的變化，氧化應(yīng)激是它們共同的損傷機(jī)制［4］。因此，利用具有生物學(xué)活性的肝損傷模型，快速而高通量地篩選護(hù)肝藥物并探索其作用原理具有重要意義。在人類及其他動(dòng)物醫(yī)藥的研制與開(kāi)發(fā)中，藥理模型的建立和應(yīng)用發(fā)揮著積極的作用，但是在水產(chǎn)領(lǐng)域，魚(yú)類保肝藥物篩選模型的研究鮮有報(bào)道。

應(yīng)用中草藥防治肝臟疾病有著悠久的歷史，很多研究表明，一些中草藥提取物及其化學(xué)成分對(duì)哺乳動(dòng)物的肝臟具有保護(hù)作用［5-6］。近幾年來(lái)，水產(chǎn)領(lǐng)域有關(guān)保肝藥物方面的研究也證實(shí)，中草藥在抗魚(yú)類肝損傷時(shí)具有良好的效果和獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，且與其抗氧化和自由基活性有關(guān)［7-10］。具抗氧化活性的中草藥有望在不久的將來(lái)成為廣為利用的治療魚(yú)肝病的高效藥。

當(dāng)歸Angelica sinesis(Oliv.)Diels.為傘形科、當(dāng)歸屬植物的干燥根，主要活性成分為阿魏酸、當(dāng)歸多糖和藁本內(nèi)酯等［11］，其具有鎮(zhèn)痛、抗損傷、增強(qiáng)免疫以及抗氧化和清除自由基等作用［12］，是中國(guó)常用中藥［13］。當(dāng)歸提取物對(duì)哺乳動(dòng)物有較好的抗氧化作用，阿魏酸能通過(guò)直接消除自由基、抑制超氧自由基引起的膜脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)以及與生物膜磷脂結(jié)合，保護(hù)膜脂質(zhì)等多種機(jī)理拮抗自由基對(duì)組織的損害［14］;當(dāng)歸多糖則通過(guò)抑制丙二醛、一氧化氮的生成，減少谷胱甘肽的清除作用，拮抗四氯化碳 (CCl4)誘導(dǎo)的氧化性肝臟損傷，表現(xiàn)出抗氧化作用［15］。然而在水產(chǎn)領(lǐng)域關(guān)于當(dāng)歸提取物的保肝和抗氧化作用研究卻少有報(bào)道。

本研究中，主要以 CCl4誘導(dǎo)建鯉 Cyprinus carpio var.Jian肝損傷，并建立急性肝損傷模型，通過(guò)檢測(cè)鯉血清和肝臟組織勻漿中相關(guān)生化指標(biāo)的變化來(lái)評(píng)價(jià)當(dāng)歸提取物對(duì)建鯉急性肝損傷的保護(hù)和抗氧化作用，旨在為進(jìn)一步高通量篩選保肝中藥，開(kāi)發(fā)魚(yú)類免疫調(diào)節(jié)和保肝中草藥配方奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑和儀器 CCl4(分析純)購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;谷丙轉(zhuǎn)氨酶 (GPT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶 (GOT)、乳酸脫氫酶 (LDH)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽 (GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)、總蛋白 (TP)、白蛋白 (Alb)和總抗氧化能力 (T-AOC)等測(cè)定試劑盒均購(gòu)自于南京建成生物工程研究所科技有限公司;723分光光度計(jì)購(gòu)自上海欣茂儀器有限公司。

1.1.2 試驗(yàn)魚(yú) 建鯉采自中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)院淡水漁業(yè)研究中心漁場(chǎng)，體質(zhì)健康無(wú)傷，6月齡，體質(zhì)量為150 g左右，飼養(yǎng)于循環(huán)水系統(tǒng)中，水溫為25℃，每天投喂商品飼料2次。

1.1.3 中草藥 當(dāng)歸提取物 (Extract from Angelica sinennsis，EAS)購(gòu)自南通四海植物提取有限公司。

1.2 方法

1.2.1 CCl4致建鯉肝損傷模型的建立 將健康建鯉隨機(jī)分為6組，每組20尾，投喂12 h后，稱重，按0.1 mL/10 g(體質(zhì)量)劑量分別一次性腹腔注射 6.25%、12.50%、15.00%、18.75%和25.00%(體積分?jǐn)?shù)，下同)的CCl4-橄欖油溶液，對(duì)照組注射等體積橄欖油溶液。觀察動(dòng)物的存活情況，于造模后24～144 h取血，測(cè)定建鯉血清中GPT、GOT、LDH活性及MDA含量。如動(dòng)物在試驗(yàn)中死亡，則不進(jìn)行測(cè)定。

1.2.2 CCl4致建鯉肝組織損傷及當(dāng)歸提取物的保護(hù)試驗(yàn) 將健康建鯉隨機(jī)分為4組，每組20尾，試驗(yàn)設(shè)4組:空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、低劑量EAS組和高劑量EAS組，其中兩對(duì)照組均飼喂基礎(chǔ)飼料，低劑量EAS組和高劑量EAS組分別飼喂含0.5%和1.0%EAS的飼料，各組均定時(shí)定量(投飼量為魚(yú)體質(zhì)量的2%)投喂商品飼料，共飼養(yǎng)60 d。飼養(yǎng)結(jié)束后，除空白對(duì)照組腹腔注射橄欖油0.1 mL/10 g(體質(zhì)量)外，其余各組均腹腔注射15.00%的CCl4-橄欖油溶液0.1 mL/10 g(體質(zhì)量)，禁食，以誘導(dǎo)肝損傷。72 h后采血分離血清，測(cè)定各組血清中GPT、GOT、LDH活性及TP和Alb等含量;同時(shí)采集各組肝臟組織，制備勻漿，測(cè)定勻漿中SOD、MDA、T-AOC和GSH等生化指標(biāo)。

1.2.3 肝組織勻漿的制備 將抽完血的魚(yú)進(jìn)行解剖，在肝臟右中葉相同部位取肝臟組織，用預(yù)冷的生理鹽水漂洗血液，剪去肝臟表面附著的結(jié)締組織，再用濾紙吸去表面水分，稱重，用眼科剪刀剪碎，移入勻漿管中，加入9倍體積的生理鹽水(體積分?jǐn)?shù)為0.86%)進(jìn)行勻漿。該勻漿以2 000 r/min離心15 min，收集上清，備用。

1.3 指標(biāo)的測(cè)定及數(shù)據(jù)分析

按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作測(cè)定 GOT、GPT、LDH、MDA、SOD、GSH、T-AOC、Alb和 Tb等生化指標(biāo)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。采用SPSS 15軟件包中的單因素方差分析 (one-way-ANOVA)進(jìn)行顯著性分析，用t檢驗(yàn)對(duì)樣本之間進(jìn)行比較。以P＜0.05和P＜0.01分別表示有顯著性和極顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 CCl4致建鯉肝損傷模型的建立

試驗(yàn)組按0.1 mL/10 g(體質(zhì)量)分別一次性腹腔注射6.25%、12.50%、15.00%、18.75%和25.00%的CCl4-橄欖油溶液，對(duì)照組注射等量橄欖油，24 h后，18.75%和25.00%的CCl4溶液造模組建鯉的死亡率分別為20%和50%，其它濃度的造模組和對(duì)照組均無(wú)死亡現(xiàn)象。6.25%、12.50%和15.00%的CCl4溶液造模組及對(duì)照組建鯉血清中GPT、GOT、LDH活性及MDA含量的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖1～圖4。

2.1.1 注射不同濃度CCl4對(duì)建鯉血清GPT活性的影響 從圖1可見(jiàn):與對(duì)照組相比，用12.50%和15.00%的CCl4溶液造模24 h均能引起建鯉血清中GPT活性極顯著性升高 (P＜0.01);兩造模組GPT活性在造模48 h最高，72 h次之，隨后迅速降低，第96 h后，GPT值恢復(fù)到接近正常水平。

圖1 CCl4濃度對(duì)建鯉血清中GPT活性的影響Fig.1 Effects of CCl4concentration on serum GPT activity in Jian common carp

2.1.2 注射不同濃度CCl4對(duì)建鯉血清GOT活性的影響 從圖2可見(jiàn):與對(duì)照組相比，用12.50%和15.00%的CCl4溶液造模24 h均能引起建鯉血清中GOT活性顯著性升高 (P＜0.05)，均維持到造模后72 h，隨后迅速降低，第96 h后，GOT值恢復(fù)到接近正常水平。

圖2 CCl4濃度對(duì)建鯉血清中GOT活性的影響Fig.2 Effects of CCl4concentration on serum GOT activity in Jian common carp

2.1.3 注射不同濃度CCl4對(duì)建鯉血清LDH活性的影響 從圖3可見(jiàn):與對(duì)照組相比，僅用15.00%的CCl4溶液造模48 h能引起建鯉血清中LDH活性顯著性升高 (P＜0.05)，維持到造模后72 h，隨后迅速降低，第96 h后，LDH值恢復(fù)到接近正常水平。

2.1.4 注射不同濃度CCl4對(duì)建鯉血清MDA含量的影響 從圖4可見(jiàn):與對(duì)照組相比，用12.50%和15.00%的CCl4溶液造模24 h均能引起血清中MDA含量極顯著性升高 (P＜0.01);12.50%CCl4溶液造模組中MDA水平在造模第72 h恢復(fù)，而15.00%CCl4溶液造模組中MDA水平維持到第96 h，MDA值恢復(fù)到接近正常水平。

圖3 CCl4濃度對(duì)建鯉血清中LDH活性的影響Fig.3 Effects of CCl4concentration on serum LDH activity in Jian common carp

圖4 CCl4濃度對(duì)建鯉血清中MDA含量的影響Fig.4 Effects of CCl4concentration on serum MDA levels in Jian common carp

綜上所述，按0.1 mL/10 g(體質(zhì)量)一次性腹腔注射15.00%的CCl4-橄欖油溶液作用72 h，比較合適構(gòu)建建鯉的肝損傷模型。

2.2 當(dāng)歸提取物的保護(hù)作用

2.2.1 EAS對(duì)CCl4致肝損傷的建鯉血清中GOT、GPT、LDH和SOD的影響 從圖5可見(jiàn):與空白對(duì)照組相比，用15.00%的CCl4-橄欖油腹腔注射建鯉72 h后，鯉血清中的GOT、GPT和LDH活性極顯著性升高 (P＜0.01)，而SOD活性極顯著性下降 (P＜0.01);與模型對(duì)照組相比，0.5%和1.0%的EAS均能顯著抑制CCl4誘導(dǎo)的鯉血清中GOT、GPT和 LDH活性升高 (P＜0.01或 P＜0.05);同時(shí)0.5%的EAS對(duì)恢復(fù)血清中的SOD活性有顯著作用 (P＜0.05)。

2.2.2 EAS對(duì)CCl4肝損傷的建鯉血清中TP和Alb的影響 從圖6可見(jiàn):與空白對(duì)照組相比，用15.00%的CCl4-橄欖油腹腔注射建鯉72 h后，鯉血清中的 TP和Alb含量極顯著性下降 (P＜0.01);與模型組相比，0.5%和1.0%的EAS均可以顯著恢復(fù)鯉血清中的TP和Alb含量 (P＜0.01或P＜0.05)。

圖5 當(dāng)歸提取物對(duì)CCl4致肝損傷的建鯉血清中GPT、GOT、LDH和SOD活性的影響Fig.5 Effects of extract from Angelica sinennsis on the activities of GPT，GOT，LDH and SOD in hepatic-damaged Jian common carp

圖6 當(dāng)歸提取物對(duì)CCl4致肝損傷的建鯉血清中總蛋白和白蛋白的影響Fig.6 Effects of extract from Angelica sinennsis on the serum total protein and albumin levels in the hepatic-damaged Jian common carp

2.2.3 EAS對(duì)CCl4肝損傷的建鯉肝組織勻漿中T-AOC、GSH、SOD和MDA的影響 從圖7可見(jiàn):與空白對(duì)照組相比，用15.00%的CCl4-橄欖油腹腔注射建鯉72 h后，肝組織勻漿中的GSH、SOD活性及T-AOC水平極顯著性下降 (P＜0.01)，MDA含量顯著性升高 (P＜0.05);與模型對(duì)照組相比，0.5%的EAS能顯著促進(jìn)組織中GSH、SOD活性及T-AOC水平恢復(fù) (P＜0.01或P＜0.05)，同時(shí)顯著抑制 MDA合成 (P＜0.05);1.0%的EAS可以顯著提高勻漿中T-AOC水平和SOD活性 (P＜0.05)，但對(duì)GSH活性和MDA含量沒(méi)有明顯影響 (P＞0.05)。

3 討論

3.1 CCl4致建鯉肝損傷模型的建立

CCl4是一種經(jīng)典的肝臟毒物，被廣泛用于構(gòu)建肝 (細(xì)胞)損傷模型以篩選保肝藥物［16］。CCl4可通過(guò)細(xì)胞色素P450作用分解為三氯甲烷自由基(CCl3·)［17］，CCl3·既能選擇性地?fù)p傷肝小葉中央?yún)^(qū)的細(xì)胞，又能迅速與O2結(jié)合轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化三氯甲烷自由基(CCl3O2·)［18］，這些自由基通過(guò)攻擊肝細(xì)胞膜上磷脂分子引起脂質(zhì)過(guò)氧化，損傷肝細(xì)胞;同時(shí)CCl4能抑制內(nèi)源性抗氧化酶(如SOD)活性，致使大量自由基無(wú)法清除，加重脂質(zhì)過(guò)氧化［19］，而MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的主要降解產(chǎn)物［20］，可嚴(yán)重?fù)p傷肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死，進(jìn)一步加重肝細(xì)胞的損傷，并阻斷膜蛋白的合成，使胞漿內(nèi)的可溶性酶滲出，導(dǎo)致血清中 GOT、GPT和LDH活性上升［21-22］。據(jù)此，本研究中選擇血清中GOT、GPT、LDH、SOD、MDA及相關(guān)輔助性生化指標(biāo)等來(lái)確定CCl4致建鯉肝損傷模型所需濃度及時(shí)間，并以此評(píng)價(jià)當(dāng)歸提取物的保肝和抗氧化作用。

構(gòu)建急性肝損傷模型來(lái)篩選保肝藥物，關(guān)鍵是造模濃度的選擇，既要求肝損傷指標(biāo)明顯，又要求高存活率。濃度過(guò)小，損傷輕，指標(biāo)變化不明顯，不利于分析保肝藥藥效;濃度過(guò)大，容易引起肝功能衰竭，導(dǎo)致死亡率增加，造成藥品和動(dòng)物的浪費(fèi)且不利于統(tǒng)計(jì)分析［23］。本試驗(yàn)在造模過(guò)程中，不僅要探索CCl4造模的劑量，還要考慮到最終的注射劑量，依據(jù)魚(yú)體質(zhì)量決定的注射劑量一次性給予太多會(huì)導(dǎo)致溶液泄漏，造成劑量不精準(zhǔn);另外，本研究中還發(fā)現(xiàn)，采用腹腔注射法來(lái)造模，能有效減少由于操作失誤導(dǎo)致的魚(yú)體死亡。通過(guò)測(cè)定血清中GOT、GPT、LDH和MDA等生化指標(biāo)，確定CCl4致建鯉肝損傷模型的最佳濃度及時(shí)間:15.00%CCl4溶液，0.1 mL/10 g(體質(zhì)量)，腹腔注射作用72 h。該急性肝損傷模型具有以下特點(diǎn):一次性給藥，劑量精準(zhǔn)，操作簡(jiǎn)單;肝損傷指標(biāo)明確;周期短，建鯉全部存活。

3.2 當(dāng)歸提取物的保護(hù)作用

CCl4在體內(nèi)形成的自由基 (CCl3·)可促使細(xì)胞膜上不飽和脂肪酸分解，最終導(dǎo)致細(xì)胞膜破壞，GOT、GPT和LDH逸出，使其在血液中的含量升高［24］。GOT和GPT是反映線粒體膜損傷和肝細(xì)胞損傷的重要指標(biāo)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，0.5%和1.0%的中藥均能顯著抑制 CCl4誘導(dǎo)的血清中GOT、GPT和LDH升高，說(shuō)明EAS能抵抗磷脂氧化，保護(hù)生物膜。當(dāng)歸提取物的兩種主要活性成分——當(dāng)歸多糖和阿魏酸鈉對(duì)大鼠和小鼠保肝作用的研究也表明，EAS有保護(hù)細(xì)胞膜完整性的作用［25-26］。

SOD是動(dòng)物機(jī)體內(nèi)的抗氧化酶，能清除自由基，防止自由基對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損傷，其活力的大小反映了機(jī)體抗氧化、清除自由基的能力［17，27-28］。GSH是一種生物體內(nèi)最豐富的三肽非酶類抗氧化劑［29-31］，可直接消除活性氧自由基，同時(shí)作為谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的底物，在清除細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫及脂過(guò)氧化物中發(fā)揮作用，GSH的多少是衡量機(jī)體抗氧化能力大小的重要因素［32］。MDA是細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，細(xì)胞中MDA含量多少可反映細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化的損傷程度［20］。當(dāng)歸的清除自由基和抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用已在哺乳動(dòng)物上做過(guò)大量的試驗(yàn)研究。曾國(guó)華等［33］在研究用阿魏酸鈉預(yù)處理對(duì)大鼠心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的延遲保護(hù)作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，其有強(qiáng)大的抗自由基損傷的作用，主要表現(xiàn)為增加SOD、GSH-Px活性，減少M(fèi)DA含量。袁新初等［34］的報(bào)道也證實(shí)，當(dāng)歸注射液的清除自由基和抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用能有效保護(hù)更年期大鼠。本研究中也得出了一致的結(jié)論，0.5%、1.0%的EAS對(duì)恢復(fù)肝損傷建鯉血清和肝臟組織中SOD、GSH含量有顯著效果;0.5%的EAS能顯著抑制MDA合成。由此可推測(cè)，EAS對(duì)CCl4誘導(dǎo)的建鯉肝組織損傷的保護(hù)作用應(yīng)與其清除自由基能力和還原能力有關(guān)，EAS能較好地恢復(fù)SOD酶活性，減少M(fèi)DA的生成及還原性GSH的消耗，從而增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力。

本研究中以CCl4為損傷劑成功建立了建鯉肝損傷模型，并研究了EAS對(duì)急性肝損傷的保護(hù)作用，結(jié)果顯示，EAS能通過(guò)提高GSH和SOD酶活力以及抑制脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA的生成來(lái)減輕CCl4對(duì)肝的損傷，減少 GPT、GOT和 LDH的釋放，對(duì)CCl4造成的肝急性損傷具有一定的保護(hù)作用，且該保護(hù)作用可能與其抗氧化、清除自由基能力有關(guān)，這將為進(jìn)一步了解EAS對(duì)損傷肝細(xì)胞保護(hù)的藥理作用機(jī)制及篩選更多的中草藥提供了基礎(chǔ)資料。

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