外源蛋白酶對虹鱒生長和腸道組織結(jié)構(gòu)的影響

張娟娟，李小勤、2，冷向軍、2，韓志英，張飛鴿

(1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海201306;2.農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點試驗室，上海201306)

虹鱒Oncorhynchus mykiss是一種名優(yōu)冷水養(yǎng)殖魚類，具有營養(yǎng)豐富、肉質(zhì)鮮嫩的特點。虹鱒屬肉食性魚類，對蛋白質(zhì)的需求比較高，虹鱒養(yǎng)殖技術(shù)規(guī)范——配合顆粒飼料 SC/T 1030.7—1999［1］中規(guī)定，虹鱒成魚階段的飼料粗蛋白含量≥40%。通常情況下，飼料配方中需要35%～40%的魚粉方可滿足其營養(yǎng)需求。但是，近年來魚粉價格昂貴，資源短缺，為降低養(yǎng)殖成本，有效的方法就是在補充限制性氨基酸的基礎(chǔ)上，以植物性蛋白替代部分魚粉，同時添加酶制劑，如蛋白酶等，以提高植物性蛋白源的利用率。烏蘭等［2］在飼料中添加0.05%、0.10%、0.15%耐高溫酶制劑 (以蛋白酶為主)飼喂奧尼羅非魚56 d，添加量為0.10%時，顯著提高了魚體增重率，降低了飼料系數(shù)。劉鼎云等［3］在魚粉含量為26.4%的飼料中添加175 mg/kg蛋白酶AG，凡納濱對蝦的增重率提高了10.8%，達(dá)到了與高魚粉組 (33%魚粉含量)基本一致的增重水平。此外，對鯉［4］、奧尼羅非魚［5］的研究表明，在低魚粉飼料中添加蛋白酶，能促進(jìn)魚體生長，提高營養(yǎng)物質(zhì)的消化率和腸道蛋白酶活性。

目前，有關(guān)蛋白酶應(yīng)用于水產(chǎn)動物方面的報道，主要集中在對溫水性魚類的研究上，而對冷水性魚類的研究相對較少。本試驗中，作者以虹鱒為研究對象，在魚粉含量為35%的飼料 (高魚粉飼料)中，以豆粕和肉骨粉等蛋白源代替20%魚粉，配制低魚粉飼料 (魚粉含量28%)，在低魚粉飼料中添加175 mg/kg蛋白酶PT，考察蛋白酶PT對虹鱒生長性能的影響，旨在為蛋白酶在水產(chǎn)飼料中的合理利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用虹鱒購于黑龍江水產(chǎn)研究所渤海冷水性魚類試驗站，初始平均體質(zhì)量為 (52.1±0.5)g。選取體質(zhì)健壯、規(guī)格一致的個體135尾，隨機分配于9個自動充氣循環(huán)養(yǎng)殖缸內(nèi) (0.60 m×0.60 m×0.50 m)，每缸放15尾魚;共3個處理組，每個處理組設(shè)3個重復(fù)。

1.2 方法

1.2.1 試驗設(shè)計及試驗飼料 以魚粉含量為35%的飼料作為高魚粉飼料組;在高魚粉飼料中，用豆粕、肉骨粉替代魚粉制成魚粉含量為28%的飼料作為低魚粉飼料組，同時補充晶體賴氨酸(0.09%)和晶體蛋氨酸 (0.05%)，使賴氨酸和蛋氨酸的含量達(dá)到與高魚粉組一致的水平;在低魚粉飼料中，添加175 mg/kg蛋白酶PT(加拿大JEFO營養(yǎng)公司生產(chǎn)并提供，為細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)物，是一種耐高溫的微堿性絲氨酸蛋白酶)作為蛋白酶飼料組。飼料配方及營養(yǎng)成分組成見表1。各組原料均粉碎并過40目，逐級混合后，由顆粒飼料機(浙江省新昌縣陳氏機械廠生產(chǎn)，KL系列)制成粒徑為2.5 mm的硬顆粒沉性飼料，晾干備用。

表1 飼料配方及營養(yǎng)成分組成Tab.1 Ingredients and approximate composition of diet w/%

1.2.2 飼養(yǎng)管理 試驗開始前，將虹鱒暫養(yǎng)3周以適應(yīng)環(huán)境。試驗正式開始時，3個處理組分別投喂高魚粉飼料、低魚粉飼料和蛋白酶飼料，每天投喂2次 (8:30，15:30)，日投飼量為魚體質(zhì)量的1.5%～2.5%，并根據(jù)溫度、攝食和魚體生長情況適當(dāng)調(diào)整，使各組保持基本一致的攝食水平，以每次投飼后無殘餌為宜。試驗期間水溫為8～14℃，溶氧為6～7 mg/L，pH為7.24～7.78。養(yǎng)殖試驗于上海海洋大學(xué)魚類營養(yǎng)實驗室進(jìn)行，養(yǎng)殖周期為60 d。

1.2.3 生長指標(biāo)的測定

1)生長性能。養(yǎng)殖試驗結(jié)束后，魚體饑餓24 h，稱重各組魚，計算增重率、飼料系數(shù)、特定生長率和成活率。

增重率(WGR，%)=100×(Wt-W0)/W0，

飼料系數(shù)(FCR)=F/(Wt-W0)，

特定增長率(SGR，%/d)=100×［ln Wtln W0］/t，

成活率(SR，%)=100×試驗?zāi)~尾數(shù)/試驗初魚尾數(shù)，

其中:Wt為終末平均體質(zhì)量 (g);W0為初始平均體質(zhì)量 (g);F為飼料攝入量 (g);t為飼養(yǎng)時間(d)。

2)肌肉基本成分分析。試驗結(jié)束后，每缸取3尾魚，每個處理組9尾，取背部白肌10 g左右，剪碎成均勻的混合物以測定虹鱒肌肉中的水分、粗蛋白、粗脂肪和粗灰分含量。其中，采用105℃恒重法 (GB/T 6435-86)測定水分，采用凱氏定氮法 (GB/T 6432-94)測定粗蛋白，采用氯仿-甲醇抽提法測定粗脂肪，采用550℃灰化法 (GB/T 6438-92)測定粗灰分。

3)胃和腸蛋白酶活力的測定。試驗結(jié)束后，每缸取3尾魚，每個處理組9尾，取腸和胃，于-80℃下保存，待測蛋白酶活力。測定時，在4℃下解凍腸和胃，用4℃去離子水漂洗，用紙吸干，稱重，加入適量4℃緩沖液，剪碎后用勻漿機在冰浴中勻漿，勻漿液在4℃下以8 000 r/min冷凍離心10 min，取上清液測定。其中，胃和胃糜添加0.1 mol/L的KCl-HCl緩沖液 (pH 1.5)，腸添加0.05 mol/L 的 Tris-HCl緩沖液 (pH 8.5)［6］。采用福林酚試劑法測定蛋白酶活力［7］。

胃蛋白酶活力定義:在pH為1.5和40℃水浴中保溫10 min，每g鮮樣組織每min水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酩氨酸定義為一個酶活力單位 (U)。

腸蛋白酶活力定義:在pH為8.5［8］和40℃水浴中保溫10 min，每g鮮樣組織每min水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸定義為一個酶活力單位 (U)。

4)前腸組織切片。采樣時，取前腸于波恩(Bouins)試劑中固定，用體積分?jǐn)?shù)為100%的酒精沖洗，用不同濃度的酒精脫水，用二甲苯透明、石蠟包埋，固定在木塊上，在切片機上連續(xù)切片(厚度為5 μm)，然后貼片、烘片、脫蠟、復(fù)水、H.E染色、脫水透明、中性樹膠封片，風(fēng)干后，于Olympus光學(xué)顯微鏡下觀察腸道結(jié)構(gòu)并拍照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用 (平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，用SPSS 17.0進(jìn)行單因素方差分析，如差異有顯著性，用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，差異顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果

2.1 蛋白酶對生長性能和肌肉成分的影響

養(yǎng)殖60 d后，各組虹鱒的生長性能見表2。低魚粉組虹鱒的增重率低于高魚粉組 (P＜0.05)，而飼料系數(shù)卻高于高魚粉組 (P＜0.05);蛋白酶組虹鱒的增重率為96.82%，比低魚粉組提高9.42%，飼料系數(shù)為1.41，比低魚粉組降低7.80%;蛋白酶組虹鱒的增重率、飼料系數(shù)與高魚粉組相比均無顯著性差異 (P＞0.05);各處理組虹鱒肌肉水分、粗蛋白、粗脂肪和粗灰分含量間均無顯著性差異 (P＞0.05)(表3)。

表2 對虹鱒生長性能的影響Tab.2 Effects of various diets on growth performance in rainbow trout

表3 對虹鱒肌肉成分的影響Tab.3 Effects of different diets on muscular approximate composition in rainbow trout w/%

2.2 蛋白酶對虹鱒腸、胃蛋白酶活力的影響

從表4可見:高魚粉組和蛋白酶組虹鱒腸蛋白酶和胃蛋白酶活力均高于低魚粉組 (P＜0.05)，但蛋白酶組、高魚粉組虹鱒腸蛋白酶和胃蛋白酶活力間無顯著性差異 (P＞0.05)。

表4 對虹鱒腸、胃蛋白酶活力的影響Tab.4 Effects of different diets on intestinal and gastric protease activities in rainbow trout U/g

2.3 蛋白酶對虹鱒前腸組織結(jié)構(gòu)的影響

對虹鱒前腸組織切片，觀察并測量前腸皺襞高度和面積。由表5可見，高魚粉組和蛋白酶組前腸皺襞高度和面積均高于低魚粉組 (P＜0.05)，但高魚粉組、蛋白酶組的前腸皺襞高度和面積均無顯著性差異 (P＞0.05)。從圖1-A、C可見，高魚粉組和蛋白酶組腸絨毛發(fā)達(dá)，排列整齊完整，固有層結(jié)締組織、黏膜肌和腸絨毛連接緊密;從圖1-B可見，低魚粉組腸絨毛的高度低于高魚粉組和蛋白酶組 (P＜0.05)，部分腸絨毛與黏膜肌分離，黏膜肌和結(jié)締組織較疏松，腸絨毛變短且前端有損傷。

圖1 虹鱒前腸組織結(jié)構(gòu) (×4)Fig.1 The tissue structure of foregut in rainbow trout(×4)

表5 蛋白酶對虹鱒前腸組織結(jié)構(gòu)的影響(n=6)Tab.5 Effects protease addition on the structure of foregut tissue in rainbow trout(n=6)

3 討論

Cheng等［9］和 Gaylord 等［10］的研究均表明，虹鱒能夠有效利用飼料中添加的外源晶體氨基酸。但在本試驗中，低魚粉飼料補充賴氨酸、蛋氨酸后，盡管其賴氨酸、蛋氨酸達(dá)到與高魚粉組一致的水平，但虹鱒的魚體增重率仍顯著低于高魚粉組，僅相當(dāng)于高魚粉組的89.8%(表2)，而飼料系數(shù)卻顯著升高。這說明，以植物蛋白、肉骨粉部分代替魚粉后，單純通過補充限制性氨基酸，仍難以達(dá)到理想的生長效果，其原因可能與植物蛋白、肉骨粉的消化率低以及缺乏一些未知生長因子等 (相對于魚粉而言)有關(guān)［11-12］，因此，通過在飼料中添加酶制劑，提高營養(yǎng)物質(zhì)消化率，是減少魚粉用量，提高替代蛋白源利用率的有效途徑。

蛋白酶是催化分解肽鍵的一類酶的總稱，能將蛋白質(zhì)降解為小分子的蛋白胨、肽和氨基酸，從而提高蛋白質(zhì)的消化利用率。冷向軍等［13］在魚粉含量為10%的飼料中添加175 mg/kg蛋白酶AG后，鯉增重率提高9.1%，飼料系數(shù)降低9.9%，同時也提高了腸道蛋白酶活性;烏蘭等［14］在對奧尼羅非魚的研究中，添加0.1%的金屬蛋白酶，可提高前腸蛋白酶活力18.83%，腸道皺襞高度也得到顯著提高;Drew等［15］用豌豆替代魚粉，添加 250 mg/kg蛋白酶后，虹鱒攝食量顯著增加，飼料系數(shù)顯著降低;此外，蛋白酶應(yīng)用在肉仔雞［16］、仔豬［17］、奶 牛［18］、異育銀鯽［19］、 草 魚［20］、 黃 顙魚［21］等的研究均表明，蛋白酶具有促進(jìn)動物生長、降低飼料系數(shù)、改善腸道組織結(jié)構(gòu)、提高消化酶活性和飼料利用率的作用。添加外源性消化酶提高消化道酶活性的原因，一方面可能是外源性消化酶直接參與對飼料成分的分解，另一方面可能是促進(jìn)了內(nèi)源性消化酶的分泌，與外源酶共同作用，從而提高魚體對營養(yǎng)成分的消化和吸收，促進(jìn)魚體生長。

本試驗中，低魚粉飼料組的虹鱒增重率及腸、胃蛋白酶活性最低，前腸組織學(xué)觀察也表明腸絨毛有部分損傷，這來源于植物蛋白相對較低的消化率及抗?fàn)I養(yǎng)因子的危害;在低魚粉飼料中添加175 mg/kg蛋白酶后，虹鱒增重率、飼料系數(shù)均得到了改善，雖未達(dá)到顯著水平，但與高魚粉組相比，已無顯著性差異;此外，虹鱒腸、胃蛋白酶的活性有顯著提高，腸絨毛發(fā)達(dá)且排列整齊，皺襞高度和面積顯著增加，增加了腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收面積，這說明蛋白酶的添加能促進(jìn)虹鱒腸道結(jié)構(gòu)的改變，提高虹鱒對飼料的消化吸收率，從而促進(jìn)其生長。

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