安徽產(chǎn)丹參高效液相色譜指紋圖譜的研究

張 穎，劉學(xué)醫(yī)，周 宙，趙寶林

安徽產(chǎn)丹參高效液相色譜指紋圖譜的研究

張 穎，劉學(xué)醫(yī)，周 宙，趙寶林

摘 要：本研究的目的是建立高效液相色譜法安徽產(chǎn)丹參藥材的指紋圖譜。所彩的方法采用HPLC法測定，以甲醇5%冰乙酸水溶液為流動(dòng)相，混合梯度洗脫，檢測波長為281nm，柱溫25℃，流速0.8ml/min。摸索并建立了安徽丹參HPLC的指紋圖譜，圖譜中各成分峰峰型良好，分離較完全，各產(chǎn)地丹參藥材在該方法下易于對(duì)比和分析。本方法穩(wěn)定可靠，對(duì)于丹參的色譜分析具有一定積極意義，可以作為控制丹參內(nèi)在質(zhì)量的方法之一，為安徽藥用丹參的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供一定依據(jù)。

關(guān)鍵詞：丹參；HPLC；指紋圖譜

張穎，劉學(xué)醫(yī)/安徽中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校講師（安徽蕪湖241000）；周宙/安徽中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校助教（安徽蕪湖241000）；趙寶林/安徽中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校副教授（安徽蕪湖241000）。

丹參為唇形科鼠尾草屬植物丹參SalviamiltiorrhizaBge的干燥根及根莖，主治瘀血所致的各種疼痛、徵瘕積聚、瘡瘍癰腫以及心悸失眠等癥，丹參主要含脂溶性二萜醌類(丹參酮I、丹參酮Ⅱ和隱丹參酮等)和水溶性酚酸類(丹參素、原兒茶酸、丹酚酸A、B等)等成分，其他還含有原兒茶醛、黃芩苷和谷氨酸等成分[1]。指紋圖譜經(jīng)過數(shù)年的發(fā)展，已成為國際公認(rèn)的控制中藥或天然藥物質(zhì)量的有效手段。安徽自古盛產(chǎn)優(yōu)質(zhì)丹參，是重要丹參的生產(chǎn)基地之一。本實(shí)驗(yàn)對(duì)安徽不同產(chǎn)地丹參藥材進(jìn)行了HPLC分析測試，摸索并建立了丹參指紋圖譜的共有模式，該方法可作為控制丹參內(nèi)在質(zhì)量的方法之一，對(duì)于全面評(píng)價(jià)丹參藥材質(zhì)量具有一定的積極意義。

一、材料與方法

（一）儀器和材料

1.儀器與試劑。美國waters E600高效液相色譜儀；waters 2489 UV/Visble Detector；浙江大學(xué)N2000色譜工作站；美國waters Symmetry C18色譜柱。上海上平儀器公司分析天平。甲醇、冰乙酸為色譜純，南京化學(xué)試劑廠生產(chǎn)，水為娃哈哈純凈水。對(duì)照品丹參素鈉（批號(hào)110855-200809）、丹酚酸B(批號(hào)111562—200807)、丹參酮ⅡA（批號(hào)110766-200619）、隱丹參酮(批號(hào)0852-9903)、丹參酮I(批號(hào)0867-2000003)、二氫丹參酮（批號(hào)0868-200002）由中國藥品生物制品檢定所提供。

2.樣品。供試品丹參由安徽中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校中藥教研室趙寶林副教授鑒定。

（二） 方法[2]

1.HPLC色譜條件。waters symmetry C18 5μm 4.6 mm×150mm色譜柱。檢測波長為281nm，柱溫25℃，流速0.8ml/min。流動(dòng)相為甲醇和5%冰乙酸水溶液混合梯度洗脫，梯度洗脫條件如表1所示。

2.對(duì)照品溶液制備。精密稱取各對(duì)照品，用甲醇配制成丹參素鈉溶液100μg/ml、丹參酮I溶液106μg/ml、隱丹參酮溶液106μg/ml、二氫丹參酮溶液 110μg/ml、丹酚酸 B溶液97μg/ml、丹參酮ⅡA溶液99μg/ml。

3.樣品溶液制備。取干燥樣品0.5g，粉碎后置于100ml圓底燒瓶中，加入50ml甲醇溶液，精密稱取其質(zhì)量后于沸水浴上加熱回流提取1h，冷卻放至室溫，依之前稱取的質(zhì)量補(bǔ)足所失甲醇，用0.45μm微孔濾膜過濾即得待測溶液。

4.測定方法。取各供試品溶液20μL，注入高效液相色譜儀中，記錄色譜圖并計(jì)算。

5.方法學(xué)考察。

（1）對(duì)照試驗(yàn)。分別吸取丹參素鈉、丹酚酸B、丹參酮ⅡA、隱丹參酮、丹參酮I、二氫丹參酮對(duì)照品溶液10μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。

（2）穩(wěn)定性和精密度試驗(yàn)。取同一份供試品溶液，分別在0.5h、2h、5h、12h、24h后進(jìn)行分析測試，考察色譜峰保留時(shí)間的一致性，各主要色譜峰保留時(shí)間的RSD均小于5%；取同一份供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，考察色譜峰保留時(shí)間的一致性，各色譜峰保留時(shí)間的RSD均小于5%。

二、指紋圖譜及各項(xiàng)技術(shù)參數(shù)

測試丹參藥材所得指紋圖譜見圖1。分析比對(duì)8個(gè)產(chǎn)地藥材供試品溶液HPLC指紋圖譜，可確定其中14個(gè)峰是所有供試品所共有的，因此確定這14個(gè)峰為共有指紋峰，其中峰14為丹參酮ⅡA，設(shè)定其為基礎(chǔ)峰。8個(gè)產(chǎn)地藥材供試溶液的共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)面積見表2和表3。

表1 HPLC梯度洗脫條件

圖1 丹參指紋圖譜

表2 共有指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間

表3 共有指紋峰的相對(duì)峰面積

三、討論

1.經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)對(duì)比，確定采用甲醇作為提取溶劑，水浴加熱回流提取1小時(shí)，提取范圍廣，可兼顧水溶性成分和脂溶性成分，提取效率高；建立了丹參藥材的指紋圖譜方法，所得圖譜峰數(shù)多且分離度好；采用加入少量乙酸的乙醇水系統(tǒng)梯度洗脫，有效的降低了丹參中酚酸所帶來的拖尾現(xiàn)象，經(jīng)過摸索，確定了洗脫時(shí)間和條件，分離效果較好，所得圖譜峰型良好，分離度高，易于比較和分析；掃描波長選擇為281nm，所得圖譜信息量豐富且峰位分布合理。

2.建立的指紋圖譜方法實(shí)用性強(qiáng)，重現(xiàn)性好，可作為丹參指紋圖譜的成熟條件加以應(yīng)用；使用指紋圖譜相似度軟件進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果表明所測試丹參藥材之間相似度大于98%，與圖譜觀察判斷一致，說明建立的指紋圖譜具有特征性，可為丹參藥材的質(zhì)量控制提供可靠依據(jù)，

3.本實(shí)驗(yàn)有待進(jìn)一步測定更多省份和批次的丹參藥材進(jìn)行研究驗(yàn)證，使應(yīng)用HPLC指紋圖譜檢定和判斷丹參藥材質(zhì)量的方法更加完善和科學(xué)。

[1]趙寶林，劉學(xué)醫(yī)，劉宏等.安徽藥用丹參資源調(diào)查研究[J].現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2010，24（5）：31-32

[2]鄭曉珂，董三麗，馮衛(wèi)生等.河南產(chǎn)丹參高效液相色譜指紋圖譜的研究[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志，2006，23（1）：57-60

中圖分類號(hào)：Q948

B

1671-6531（2012）10-0037-02

安徽省高校青年教師資助計(jì)劃項(xiàng)目 （編號(hào)：2008jq1171）；安徽高校省級(jí)自然科學(xué)研究項(xiàng)目 （編號(hào)：KJ2008B078）

：何 巖