鵝膏菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)培養(yǎng)條件優(yōu)化及安全性分析1)

冀瑞卿 李 玉

(吉林農(nóng)業(yè)大學，長春，130018)

宋瑞清

(東北林業(yè)大學)

鵝膏屬(Amanita)真菌隸屬于傘菌亞綱(Agaricomycetidae)、傘菌目(Agaricales)、鵝膏科(Amanitaceae)［1］，其絕大多數(shù)是專性菌根菌，與松科、殼斗科、樺木科以及楊柳科的許多植物建立共生互惠的外生菌根關(guān)系［2］。鵝膏菌有很多是美味的食用菌，如:Amanita esculenta Hongo＆Matsuda，橙蓋鵝膏菌(Amanita caesarea(Scop.:Fr.)Pers.ex Schw.)等［3］，但是有毒鵝膏菌更引人關(guān)注。對于鵝膏菌有毒物質(zhì)及其毒理的研究頗受毒理學、化學、生物學和醫(yī)學等研究人員的重視，至今已有100多年的研究歷史。目前已分離鑒定的鵝膏菌毒素有多種［4－6］。將鵝膏菌的活性物質(zhì)用于有害生物的防治也有記載［7］，如Amanita muscaria 就是因其對蒼蠅有毒而得名毒蠅鵝膏［8］，鵝膏菌的抑菌物質(zhì)對病蟲害的防治效果也很顯著［9－11］，然而在將其應用到實踐中與環(huán)境條件的適應性怎么樣?對環(huán)境能夠造成多大的影響等一系列的問題還需要更深入的研究，筆者就鵝膏菌菌株AV抑菌物質(zhì)的最佳營養(yǎng)條件和非營養(yǎng)條件、對溫度和紫外線的敏感問題，以及通過小鼠試驗對鵝膏菌菌株AV抑菌物質(zhì)對環(huán)境的安全性進行研究，保證其應用的生態(tài)安全性，在控制植物病原菌的同時不危害人類或其他生物的生長代謝，為其進一步的推廣奠定理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗菌株:鵝膏菌菌株AV由東北林業(yè)大學病理教研室提供;試驗動物為昆明種小鼠，體質(zhì)量(19.15±0.15)g，雌、雄各半，購自黑龍江省腫瘤醫(yī)院動物試驗中心。

試驗用培養(yǎng)基及其配方:①基礎(chǔ)培養(yǎng)基。葡萄糖 20.0 g，馬鈴薯 200.0 g，MgSO41.5 g，KH2PO43.0 g，瓊脂 20.0 g，水 1000.0 mL，自然 pH 值。②碳源培養(yǎng)基。各種碳源 20.0 g，蛋白胨 2.0 g，MgSO41.5 g，KH2PO43.0 g，水1000.0 mL，自然 pH 值。③氮源培養(yǎng)基。各種氮源 2.0 g，葡萄糖 20.0 g，MgSO41.5 g，KH2PO43.0 g，水1000.0 mL，自然 pH 值。④改良PD培養(yǎng)基。葡萄糖20.0 g，馬鈴薯200.0 g，MgSO41.5 g，KH2PO43.0 g，水1000 mL，自然 pH 值。

培養(yǎng)方法:切取PDA平板培養(yǎng)7 d的同質(zhì)等量的菌片接種到盛有300 mL改良PD培養(yǎng)基的三角瓶(500 mL)中，置旋轉(zhuǎn)式搖床160 r/min、25℃培養(yǎng)15 d(小菌球布滿培養(yǎng)瓶)。按等濕重接種法接種，接含1 g濕菌球的二級種培養(yǎng)液到液體培養(yǎng)基中，設3個重復，搖床培養(yǎng)160 r/min、25℃、7 d。

評價指標:①發(fā)酵液菌絲生物量。由菌絲干質(zhì)量確定。②抑菌物質(zhì)活性。將發(fā)酵液進行超聲波處理后，利用紫外—可見光分光光度計在226、218 nm下比色測定抑菌物質(zhì)活性［12］，對照為相對應的液體培養(yǎng)基。

試驗設計:①營養(yǎng)因子的單因子試驗。分別以各碳源或氮源培養(yǎng)基為培養(yǎng)基質(zhì)，二級種為種子液，接種量為10%，裝液量為75%，pH自然。搖床培養(yǎng)160 r/min、25℃、7 d，收集菌絲，通過生物量和比色值確定最佳營養(yǎng)元素。②營養(yǎng)因子的正交試驗。5因子4水平的因子水平表設置如表1。以二級種為種子液，接種量均為10%，裝液量為75%，pH自然，搖床培養(yǎng)(160 r/min，25℃)7 d，收集菌絲，通過生物量和比色值確定營養(yǎng)元素間的影響作用。③不同環(huán)境因素的影響。以正交試驗確定的最佳培養(yǎng)基①為培養(yǎng)基，二級種為種子液，各影響因素的梯度設定如下:pH 為 4、5、6、7、8、9;裝液量為 30、50、75 mL;接種量為 0.75%、1.00%、1.25%;培養(yǎng)時間為 7、15、20 d;培養(yǎng)溫度為15、18、25、30、35、40 ℃;搖床轉(zhuǎn)速為 60、80、120、140、160、180 r/min，搖床培養(yǎng) 7 d，收集菌絲，通過生物量和比色值確定最佳培養(yǎng)條件。

分離物Ⅳ［13］對環(huán)境的耐受性分析:①對溫度敏感性。分別在 25、35、45、55、65、75、85、100 ℃下處理分離物Ⅳ2 h，在226、218 nm下比色測定抑菌物質(zhì)活性。②對紫外光的敏感性。分離物Ⅳ在紫外燈下分別照射0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 h 后分別比色測定抑菌物質(zhì)活性。③對酸堿度的敏感性。分別用6 mol/L HCl和6 mol/L NaOH調(diào)酸堿度，使分離物Ⅳ的 pH 值為 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12，分別進行比色測定抑菌物質(zhì)活性。

表1 鵝膏菌菌株AV培養(yǎng)因子的L16(45)正交試驗因素水平 g·L－1

菌株AV抑菌物質(zhì)對環(huán)境中其他生物的影響:①小鼠急性毒性試驗。采用口服菌絲體方式飼喂小鼠。給藥前禁食16 h，不禁水。菌絲體分為4個劑量組(表7)。每劑量組飼喂10只小鼠。給藥后觀察小鼠的反應情況，記錄中毒癥狀和死亡情況;試驗之前作預試驗確定致死范圍。②小鼠異常毒性試驗。采用皮下注射的方式進行試驗，將菌株AV粗提液(分離物Ⅳ)冷凍干燥的粉末用無菌生理鹽水配制成質(zhì)量濃度為2 g/L的溶液備用。粗提液給藥質(zhì)量濃度為 0.06、1.00、2.00 g/L，分離物Ⅳ給藥質(zhì)量濃度為 0.02、0.06、0.10、1.00、2.00 g/L。給藥劑量為每只小鼠每天0.5 mL，每劑量組10只小鼠，觀察7 d，對照為正常飼喂小鼠。采用改進寇氏法［14］計算LD50。

2 結(jié)果與分析

2.1 營養(yǎng)因子對抑菌活性的影響

2.1.1 營養(yǎng)因子的單因子試驗

不同碳源、氮源對生物量及抑菌活性的影響不同(表2)。菌株AV利用較好的碳源是乳糖、蔗糖和葡萄糖，在這3種碳源培養(yǎng)基中，菌絲體生物量間無顯著差異。從吸光度來看，以乳糖為碳源的提取液在226、218 nm下均最高。因此將乳糖作為菌株AV菌絲生長的最佳碳源。

表2 營養(yǎng)元素對鵝膏菌菌株AV的生物量和抑菌物質(zhì)活性的影響

從菌絲體生物量來看，乙酸銨、天門冬氨酸和蛋白胨是菌株AV生長利用很好的氮源;以蛋白胨為氮源的提取液在226、218 nm下的吸光度最大，即抑菌活性物質(zhì)的含量較高。因此將蛋白胨作為菌株AV菌絲生長的最佳氮源。

2.1.2 營養(yǎng)因子的正交試驗

由極差來看，對菌株AV生物量影響最大的是MgSO4的用量，其次是乳糖、KH2PO4、蛋白胨，但方差分析表明，4種營養(yǎng)元素對生物量影響結(jié)果在α=0.05下無顯著差異(表4)。而以抑菌活性物質(zhì)吸光度(226、218 nm)為衡量指標進行的正交分析顯示(表 3)，影響因素由主到次是乳糖、MgSO4、KH2PO4、蛋白胨，方差分析結(jié)果(表4)表明4個因素中乳糖是影響菌株AV抑菌活性物質(zhì)含量的最重要因素，與其他的3個因素有顯著性差異(α=0.05)，其他3個因素間無顯著差異。最佳組合為:①乳糖30.0 g/L，蛋 白 胨 0.50 g/L，MgSO41.5 g/L，KH2PO44.5 g/L;②乳糖 10.00 g/L，蛋白胨 0.50 g/L，MgSO40.75 g/L，KH2PO44.50 g/L;③乳糖30.0 g/L，蛋白胨 2.0 g/L，MgSO41.5 g/L，KH2PO43.0 g/L。

表3 鵝膏菌菌株AV各營養(yǎng)因子正交試驗的直觀分析結(jié)果

表4 鵝膏菌菌株AV各營養(yǎng)因子正交試驗的方差分析結(jié)果

2.2 培養(yǎng)環(huán)境因子對抑菌活性的影響

表5顯示了培養(yǎng)環(huán)境因子對于菌株AV菌絲生物量和抑菌活性物質(zhì)活性的影響情況。其生物量和抑菌物質(zhì)的含量最高的培養(yǎng)條件為:pH值5～6，溫度25℃，接種量1.25%，裝液量50%，搖床轉(zhuǎn)數(shù)180 r/min，培養(yǎng)時間 20 d。

2.3 粗提物Ⅳ對于不同培養(yǎng)環(huán)境的耐受性

由表6可見，溫度對菌株AV抑菌活性物質(zhì)活性影響較大。隨著溫度的升高，抑菌活性物質(zhì)活性降低。25～65℃對粗提物Ⅳ活性的影響比較小，之間無顯著性差異(α=0.01);溫度超過75℃時，菌株AV抑菌活性物質(zhì)活性急速下降，與前幾個溫度處理形成顯著差異;在100℃時，幾乎檢測不到活性。紫外照射對菌株AV抑菌活性物質(zhì)活性有一定的影響。

表5 不同培養(yǎng)環(huán)境下鵝膏菌菌株AV的生物量和抑菌活性

隨著照射時間的增加，抑菌物質(zhì)活性逐漸下降，紫外照射4 h以下對活性影響較小，4 h前的處理間無顯著差異(α=0.01)，但4～8 h照射后活性下降比較快，其活性分別與前幾個照射時間的活性呈顯著差異(α=0.01)。pH值對菌株AV抑菌活性物質(zhì)活性影響較大。pH值6～7，抑菌活性物質(zhì)活性穩(wěn)定;pH＜6(或者pH﹥7)，隨著pH降低(或增加)，抑菌活性物質(zhì)活性急速下降，之間形成顯著性差異(α=0.01);酸堿對抑菌物質(zhì)的活性都有影響，尤其是pH＜5或者pH＞5時活性下降更快。

表6 不同環(huán)境因子對鵝膏菌菌株AV抑菌物質(zhì)活性的影響

2.4 小鼠急性毒性分析

用鵝膏菌菌株AV菌絲體飼喂小鼠LD50為418.70 mg/kg，95%可信限為 453.11 ～ 386.90 mg/kg。具體試驗結(jié)果見表7。

表7 鵝膏菌菌株AV菌絲體的小鼠急性毒性試驗結(jié)果

2.5 小鼠異常試驗結(jié)果

前期抑菌試驗結(jié)果表明，粗提液及分離物Ⅳ抑菌效果最好的最高質(zhì)量濃度為0.06 g/L［13］，將這個質(zhì)量濃度分別減小或加大對小鼠進行皮下注射試驗10 d，其質(zhì)量濃度加大到2 g/L也沒有危及小鼠生命，而且小鼠體質(zhì)量明顯增大。10 d后解剖結(jié)果表明:粗提液為2 g/L時，小鼠內(nèi)臟未發(fā)現(xiàn)異常;分離物Ⅳ2 g/L時，小鼠內(nèi)臟有異常變化(表8)。所以安全劑量應小于2 g/L。此質(zhì)量濃度比實際抑菌所用的高30多倍，因此，將鵝膏菌菌株AV抑菌活性物質(zhì)(粗提液或分離液Ⅳ)用于楊樹爛皮?。?3］的防治對生態(tài)安全。

3 結(jié)論與討論

通過最佳培養(yǎng)基及其最佳培養(yǎng)環(huán)境的選擇得到鵝膏菌菌株AV最適的培養(yǎng)條件:最佳碳源為乳糖，最佳氮源為蛋白胨，而且在供試的幾種營養(yǎng)元素中，碳源是影響菌株AV生物量及其抑菌物質(zhì)產(chǎn)生的最主要因素。最佳培養(yǎng)基組合為:①乳糖30.0 g/L，蛋白胨 0.5 g/L，MgSO41.5 g/L，KH2PO44.5 g/L;②乳糖10.00 g/L，蛋白胨 0.50 g/L，MgSO40.75 g/L，KH2PO44.50 g/L;③乳糖30.0 g/L，蛋白胨2.0 g/L，MgSO41.5 g/L，KH2PO43.0 g/L。產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)最適合培養(yǎng)條件為:pH值5～6，溫度25℃，接種量1.25%，裝液量50%，搖床轉(zhuǎn)數(shù)180 r/min，培養(yǎng)時間20 d。

表8 鵝膏菌菌株AV粗提液和分離物Ⅳ對小鼠的影響

比色測定時，226、218 nm下結(jié)果一致，抑菌物質(zhì)化學結(jié)構(gòu)還需更進一步試驗證明，但初步認為是酰胺類物質(zhì)［11］，在水溶劑中發(fā)色團可能是烷基［12］。對極端環(huán)境的敏感性分析的結(jié)果顯示，分離物Ⅳ在環(huán)境中相對比較穩(wěn)定，但是在溫度超過75℃，pH大于9或小于4時，或者紫外照射時間超過4h會影響其抑菌物質(zhì)活性。正常的試驗條件下抑菌活性對溫度和光照的穩(wěn)定性比較好，對酸堿度比較敏感;但是從另一個角度考慮，在實踐應用中此物質(zhì)會不會造成高殘留對環(huán)境造成影響，還需進一步的深入研究。小鼠的毒性試驗結(jié)果表明，抑菌物質(zhì)質(zhì)量濃度在2 g/L以內(nèi)對小鼠無影響，可見在實際應用時控制抑菌物質(zhì)的質(zhì)量濃度非常重要。

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