芥子堿硫氰酸鹽清除超氧陰離子自由基作用的研究

李默影，齊 潔，吳秋月，劉麗芳

(中國藥科大學(xué)天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點實驗室，江蘇南京210009)

芥子堿硫氰酸鹽清除超氧陰離子自由基作用的研究

李默影，齊 潔，吳秋月，劉麗芳*

(中國藥科大學(xué)天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點實驗室，江蘇南京210009)

目的：研究芥子堿硫氰酸鹽清除超氧陰離子自由基的作用。方法：用化學(xué)發(fā)光法測定芥子堿硫氰酸鹽清除超氧陰離子自由基的能力，并以抗壞血酸的清除能力做為對照，以IC50值(清除率為50%時的濃度值)作為評價指標(biāo)。結(jié)果：芥子堿硫氰酸鹽和抗壞血酸的IC50值分別為0.135 mmol/L和18.74 mmol/L，后者的IC50值約為前者的140倍。結(jié)論：芥子堿硫氰酸鹽具有良好的抗氧化作用，可以作為天然抗氧化劑進(jìn)行開發(fā)。

芥子堿硫氰酸鹽;超氧陰離子自由基;清除率;IC50值

芥子堿硫氰酸鹽(Sinapine cyanide sulfonafe)是芥子堿(Sinapine)存在于十字花科植物中的一種常見形式［1］。近年來的研究揭示了芥子堿是一種非常有價值的天然抗氧化劑［2］，在抗衰老藥物的研究中具有重要意義。

研究已經(jīng)證實，體內(nèi)多余的超氧陰離子自由基(·O2－)嚴(yán)重危害人類的健康。超氧陰離子自由基(·O2－)主要損害細(xì)胞膜包括血管內(nèi)皮細(xì)胞膜及亞微結(jié)構(gòu)，并引起一系列有害的生化反應(yīng)［3］。對于清除超氧陰離子自由基的測定，文獻(xiàn)報道的方法較多，有化學(xué)發(fā)光法［4］、極譜法［5］、電泳法［6］等。其中化學(xué)發(fā)光測定法是儀器分析中靈敏度最高的方法之一，已在醫(yī)學(xué)、環(huán)境以及工業(yè)分析等許多領(lǐng)域里得到廣泛的應(yīng)用。

本文采用化學(xué)發(fā)光法，以鄰苯三酚－魯米諾(PA－L)作為自氧化化學(xué)發(fā)光體系，以抗壞血酸(Vc)作為對照藥物，測定芥子堿硫氰酸鹽清除超氧陰離子自由基的能力。以期為其在抗衰老藥物研究中的應(yīng)用提供一定的依據(jù)。

1 材料和方法

1.1儀器與試劑

SHG－C生物化學(xué)發(fā)光測量儀(上海上立檢測儀器廠);PHS－25型酸度計(上海雷磁儀器廠)。

芥子堿硫氰酸鹽(自白芥子中提取，經(jīng)13CNMR、1HNMR、元素分析等鑒定為芥子堿硫氰酸鹽，純度大于98%(HPLC))。魯米諾(3－氨基鄰苯二甲酰肼)，鄰苯三酚均購于Sigma公司。

1.2 發(fā)光體系的配制

魯米諾儲備液的配制：取魯米諾(luminol，3－Aminophthalhydrazide，3－氨基鄰苯二甲酰肼，C8H7N3O2，M=177.16)17.7mg 溶于 100 mL 0.1 mol/L的 Na2CO3水溶液中，搖勻，即得(濃度：1 mmol/L)。

鄰苯三酚溶液的配制：取鄰苯三酚(pyrogallol，C6H3(OH)3，M=126.11)126mg和乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetra － aceticacid，C10H16O8N2，M=292.25)7.74 mg溶于1 mmol/L的鹽酸溶液(濃度：0.01 mol/L)，臨用時用蒸餾水稀釋 10倍(1 mmol/L)。

碳酸緩沖液(pH值10.2)的配制：取0.1 mol/L Na2CO3210 mL于500 mL三角瓶中，加入0.1 mol/L NaHCO3溶液90 mL后混勻，再加入111.6mg乙二胺四乙酸，調(diào)pH為10.2，，即得。

1.3 方法

魯米諾試驗液：取1 mmol/L魯米諾儲備液與碳酸緩沖液(pH10.2)按(1∶2)的比例混合均勻(臨用前配制)。

樣品液：精密稱取芥子堿硫氰酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品10.35 mg，置1 mL容量瓶中加純凈水溶解至刻度，搖勻，即得(濃度10.35 mg/mL)。

對照液：精密稱取抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)品(Vc)10.00 mg，置1 mL容量瓶中加DMSO溶解至刻度，搖勻，即得(濃度10.00 mg/mL)。

取10 μl樣品液加20 μL 1 mmol/L鄰苯三酚溶液，加970 μL魯米諾試驗液(總體積1 mL)混合置于發(fā)光儀中測定，發(fā)光強(qiáng)度(chemiluminescence，CL)以峰高計算。

空白實驗以空白溶劑代替樣品溶液試驗。

對照實驗以對照液代替樣品溶液試驗。以下式計算清除率：

清除率=［CL(空白)－ CL(樣品)］÷CL(空白)

清除率為50%時樣品的濃度即為其 IC50值。IC50值越小說明該樣品清除超氧陰離子自由基的能力越強(qiáng)。

2 結(jié)果

芥子堿硫氰酸鹽抗氧化能力的測定結(jié)果見表1。

表1 樣品(芥子堿硫氰酸鹽)的測定結(jié)果

以后4組數(shù)據(jù)濃度值的自然對數(shù)為橫坐標(biāo)，清除率為縱坐標(biāo)繪制散點圖，經(jīng)線性回歸得方程：y=0.186ln(x)+1.4865，R2=0.987 7，由該方程計算出芥子堿硫氰酸鹽的IC50=0.004 97×原液濃度=0.05 mg/mL，即 0.135 mmol/L。

以4組數(shù)據(jù)濃度值的自然對數(shù)為橫坐標(biāo)，清除率為縱坐標(biāo)繪制散點圖，經(jīng)線性回歸得方程：y=50.044ln(x)+103.1，R2=0.948 4，由該方程計算出抗壞血酸的IC50=0.329 76×原液濃度=3.297 6mg/mL，即18.74 mmol/L。

3 結(jié)論

芥子堿硫氰酸鹽清除超氧陰離子自由基的實驗結(jié)果表明其具有良好的抗氧化作用，能有效清除·O2－。這個作用明顯優(yōu)于對照藥物抗壞血酸，后者的IC50約為前者的140倍。芥子堿硫氰酸鹽分子量小，易于吸收，為開發(fā)新型具有抗氧化功能的化妝品、保健品和藥物提供了新的思路。

［1］ 柯木根，吳國欣，林燕妮，等.芥子堿的研究概況［J］.中草藥，2007，38(9)，1436－ 附3.

［2］ 李群，顧瑞琦.十字花科植物中的芥子堿對果蠅的抗衰老作用［J］.應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報，1999，5(1)：32.

［3］ 李培峰，方允中.活性氧對蛋白質(zhì)的損傷作用［J］.生命的化學(xué)，1994，14(6)：1 －3.

［4］ 董彩軍，謝明勇，聶少平，等.青錢柳提取物體外抗氧化活性研究［J］.食品科學(xué)，2007，28(10)：31 －34.

［5］ 李明靜，慶偉霞，楊玉霞，等.七種天然黃酮類化合物對超氧陰離子自由基的清除活性［J］.化學(xué)研究，2006，17(10)：73 －75.

［6］ 傅崇崗，楊冬芝.電泳中介微分析法測定超氧化物歧化酶［J］.分析化學(xué)，2006，34(4)：517 －520.

Study on the Scavenging Effect of Superoxide Free Radicals by Sinapine Cyanide Sulfonafe

Li Moying，Qi Jie，Wu Qiuyue，Liu Lifang
(State Key Laboratory of Natural Medicines，China Pharmaceutical University，Nanjing 210009，China)

Objective：To study the scavenging effect of superoxide free radicals by sinapine cyanide sulfonafe.Method：Through chemiluminescence method，the scavenging power of sinapine cyanide sulfonafe on superoxide free radicals was determined.The scavenging power was compared to ascorbic acid and the evaluation index is IC50(the concentration when the scavenging rate is 50%).Results：The IC50of sinapine cyanide sulfonafe and ascorbic acid are 0.135mmol/L and 18.74mmol/L，respectively.The latter is about 140 times of the former.Conclusion：Sinapine cyanide sulfonafe has the very good antioxidant effect and can be developed as a natural antioxidant.

sinapine cyanide sulfonafe;superoxide free radicals;scavenging rate;IC50

R285

A

1006－9690(2012)03－0011－02

10.3969/j.issn.1006－9690.2012.03.003

2011－08－05

李默影(1986－)，女，在讀碩士研究生，主要從事中藥分析研究。

*通訊作者：劉麗芳(1969－)，女，江西萍鄉(xiāng)人，博士，教授，主要從事中藥活性成分研究。E－mail：liulifang69@126.com