參附注射液對(duì)腹腔感染大鼠血內(nèi)毒素、小腸黏膜HSP－70表達(dá)的影響

胡培陽 胡曉飛 屠巍巍 陳中明 何露莎 王果

參附注射液對(duì)腹腔感染大鼠血內(nèi)毒素、小腸黏膜HSP－70表達(dá)的影響

胡培陽 胡曉飛 屠巍巍 陳中明 何露莎 王果

目的探討參附注射液對(duì)腹腔感染大鼠血內(nèi)毒素水平、小腸黏膜熱休克蛋白－70(HSP－70)的表達(dá)及腸黏膜屏障功能的影響。方法健康雄性SD大鼠60，隨機(jī)分為假手術(shù)組、腹腔感染組和參附注射液組，每組20只。假手術(shù)組僅行單純剖腹手術(shù);感染組采用盲腸結(jié)扎加穿孔(CLP)手術(shù)制作嚴(yán)重腹腔感染模型;參附注射液組行CLP后以參附注射液［10ml/(kg·d)］靜脈注射。術(shù)后第5天，統(tǒng)計(jì)各組大鼠的死亡率，檢測(cè)血內(nèi)毒素水平、小腸黏膜HSP－70表達(dá)，并作小腸黏膜Chiu評(píng)分。結(jié)果參附注射液組大鼠死亡率明顯低于腹腔感染組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。與腹腔感染組相比，參附注射組大鼠血內(nèi)毒素水平顯著降低(P＜0．05)，小腸黏膜HSP－70表達(dá)明顯升高(P＜0．05)，小腸黏膜Chiu氏評(píng)分也較低(P＜0．05)。結(jié)論參附注射液可降低腹腔感染大鼠血內(nèi)毒素水平，促進(jìn)腸黏膜細(xì)胞HSP－70的表達(dá)，保護(hù)腸黏膜的屏障功能，從而降低腹腔感染大鼠的死亡率。

參附注射液SD大鼠內(nèi)毒素腸黏膜屏障熱休克蛋白－70

材料與方法

1．實(shí)驗(yàn)材料:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為清潔級(jí)健康雄性SD大鼠60只，體重200～250g，8周齡，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供［合格證號(hào):SYXK(浙)2008－0115］。參附注射液購(gòu)自雅安三九藥業(yè)有限公司，產(chǎn)品批號(hào)為國(guó)藥準(zhǔn)字Z090202)。內(nèi)毒素檢測(cè)用顯色基質(zhì)鱟試劑盒(終點(diǎn)顯色法，含偶蛋化試劑)購(gòu)自廈門市鱟試劑廠有限公司(批號(hào):090808)。HSP－70免疫組化相關(guān)試劑購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。高清晰度病理圖像分析系統(tǒng)由同濟(jì)科技集團(tuán)千屏影像工程公司提供。

2．動(dòng)物分組與造模:取健康雄性SD大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分成假手術(shù)組，腹腔感染組和參附注射液組，每組20只。參附注射液組采用盲腸結(jié)扎加穿孔手術(shù)(cecum ligation and perforation，CLP)制作嚴(yán)重腹腔感染模型行，術(shù)后予參附注射液［10ml/(kg·d)］靜脈注射5天，每天1次［3］;感染組同樣采用CLP制作嚴(yán)重腹腔感染模型，假手術(shù)組僅行單純剖腹手術(shù);后兩組術(shù)后均予生理鹽水［10ml/(kg·d)］靜脈注射5天，每天1次。

3．標(biāo)本采集:術(shù)后第5天，存活的SD大鼠予3%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，抽取下腔靜脈血其中1ml與配套血液抗凝劑1ml混勻后置于冰水中，以1000r/min低溫離心10min，取其上清用于內(nèi)毒素檢測(cè)。取Treits韌帶下約15～20cm處一段小腸組織，固定切片后用于觀察腸黏膜病理變化和小腸黏膜HSP－70蛋白表達(dá)檢測(cè)。

4．血清內(nèi)毒素檢測(cè):采用偶氮終點(diǎn)顯色法鱟試驗(yàn)(LAL)定量測(cè)定血漿內(nèi)毒素的濃度，WSOFTMAX軟件處理內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液得到的OD值，自動(dòng)計(jì)算待測(cè)樣品內(nèi)毒素含量。

5．小腸黏膜損傷程度評(píng)定:小腸標(biāo)本部分行常規(guī)石蠟切片，HE染色，根據(jù)Chiu氏6級(jí)評(píng)分對(duì)小腸的損傷程度進(jìn)行評(píng)定，雙盲法判讀腸黏膜病理切片并記分［4］。0分:正常黏膜絨毛;1分:上皮下間隙增大，通常在絨毛的尖端，常伴隨有毛細(xì)血管淤血;2分:上皮下間隙擴(kuò)張伴隨上皮層同固有層的中度分離;3分:絨毛兩側(cè)上皮層大量的同固有層分離，部分絨毛頂端破損;4分:絨毛破損伴隨固有層毛細(xì)血管暴露，可能觀察到固有層的細(xì)胞成分增多;5分:固有層破壞和不完整、出血和潰瘍。

6．小腸黏膜HSP－70蛋白檢測(cè)(免疫組化法):另一部分小腸組織切片脫蠟至水，微波修復(fù)(5min×2次)，室溫冷卻，3%H2O2封閉30min，PBS沖洗后(5min×2次)，羊血清封閉30min(37℃水浴)，滴加HSP－70抗體37℃水浴30min，PBS沖洗(5min×2次)，滴加Ⅱ抗(羊抗鼠)37℃水浴30min，再行PBS沖洗(5min×2次)，DAB顯色5～10min，蘇木精淡染，0.1%鹽酸、乙醇分化，返藍(lán)，脫水、透明、中性樹膠封片。陽性反應(yīng)為細(xì)胞染成棕黃色或有棕黃色顆粒沉積。

陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)方法:采用雙盲法在每張切片中選取有代表性的區(qū)域，在高倍鏡(10×40)下計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞中的陽性細(xì)胞數(shù)(輔以計(jì)算機(jī)圖像分析軟件IPP6．0自動(dòng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)數(shù))，每組數(shù)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。個(gè)別壞死細(xì)胞及周邊著色細(xì)胞不計(jì)入陽性細(xì)胞內(nèi)。

7．統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS 17．0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。本實(shí)驗(yàn)計(jì)量資料以采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的方差分析，組間比較采用SNK－q檢驗(yàn)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示，計(jì)數(shù)資料采用行×列表卡方檢驗(yàn)。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1．大鼠實(shí)驗(yàn)后死亡情況(表1):假手術(shù)組術(shù)后5天均未出現(xiàn)死亡，死亡率為0%;腹腔感染前3天共死亡10只，總死亡率為50%;參附注射液組前3天共死亡4只，總體死亡率為20%。與假手術(shù)組相比，腹腔感染組大鼠死亡率顯著升高(P＜0．01)。而采用參附注射液治療后，參附注射液組大鼠死亡率與生理鹽水治療的腹腔感染組大鼠死亡率比較略有降低(P＜0．05)。

表1 3組大鼠在24、48、72h內(nèi)死亡數(shù)及死亡率

2．3組間內(nèi)毒素水平比較(表2):術(shù)后第5天，腹腔感染組內(nèi)毒素含量明顯高于假手術(shù)組和參附注射液治療組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05);參附注射液組內(nèi)毒素水平雖較假手術(shù)組高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)。

表2 3組術(shù)后第5天血內(nèi)毒素水平比較

3．小腸黏膜Chiu氏評(píng)分(圖1、表3):假手術(shù)組小腸黏膜病理大多表現(xiàn)為正常絨毛(Chiu氏評(píng)分:0分)，腹腔感染組小腸病理以絨毛上下皮間隙增大為主(Chiu氏評(píng)分:1分)，參附注射液治療組小腸多表現(xiàn)為正常絨毛和絨毛上下皮間隙增大。3組均未見絨毛兩側(cè)上皮層大量的同固有層分離，部分絨毛頂端破損;絨毛破損伴隨固有層毛細(xì)血管暴露，固有層的細(xì)胞成分增多;固有層破壞和不完整、出血和潰瘍等病理表現(xiàn)。

圖1 小腸黏膜Chiu氏評(píng)分(HE染色)

表3 大鼠小腸黏膜病理Chiu氏評(píng)分及10×40倍下各組大鼠1000個(gè)腸黏膜細(xì)胞中HSP－70陽性細(xì)胞數(shù)

4．各組大鼠腸黏膜HSP－70的表達(dá)(圖2、表3):顯微鏡下所見:腹腔感染組和參附注射液組的大鼠小腸黏膜HSP－70表達(dá)主要集中在固有層的淋巴細(xì)胞，黏膜下層結(jié)締組織及成纖維細(xì)胞中也有陽性表達(dá)。參附注射液組HSP－70表達(dá)陽性者多為整個(gè)細(xì)胞染成棕黃色，而對(duì)照組及假手術(shù)組則多見陽性細(xì)胞中黃色顆粒，見圖2。與假手術(shù)組相比，參附注射液組腸黏膜HSP－70表達(dá)顯著升高(P＜0．05)，而腹腔感染組HSP－70表達(dá)表達(dá)略有升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。并且，與腹腔感染組大鼠相比，參附注射液組腸黏膜HSP－70的表達(dá)差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 3組大鼠小腸黏膜HSP－70表達(dá)情況(蘇木素染色，×100)

討論

腹腔感染是普通外科常見疾病之一，多繼發(fā)于腹腔內(nèi)臟器炎癥穿孔、損傷破裂或手術(shù)后并發(fā)癥等。嚴(yán)重腹腔感染可引起腸黏膜屏障損傷，腸道細(xì)菌易位，繼發(fā)細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)的連鎖反應(yīng)，導(dǎo)致感染性休克甚至多器官功能障礙(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)。

內(nèi)毒素是革蘭陰性桿菌產(chǎn)生的一種重要產(chǎn)物，腹腔感染膿毒癥時(shí)，其水平可明顯升高。內(nèi)毒素可以抑制腸道的蠕動(dòng)、分泌、消化和免疫防御作用，引起黏膜水腫，使腸絨毛頂部細(xì)胞壞死，腸通透性增加，從而破壞腸黏膜屏障功能。內(nèi)毒素還可以激活補(bǔ)體、激活血液凝固，通過產(chǎn)生刺激血管的激素和激活巨噬細(xì)胞的IL－1損害腸屏障［5］。在本研究中，筆者觀察到假手術(shù)組小腸黏膜各層結(jié)構(gòu)完整，腸絨毛排列整齊，而腹腔感染組腸黏膜下層間質(zhì)水腫、血管充血，腸絨毛毛細(xì)血管充血，部分區(qū)域有黏膜上皮脫落，漿膜層明顯炎性滲出，腸黏膜的Chiu氏評(píng)分假手術(shù)組高，并且腹腔感染組大鼠組血清內(nèi)毒素水平較假手術(shù)組高。本研究的結(jié)果支持內(nèi)毒素對(duì)腸黏膜屏障具有破壞作用。另一方面，我們發(fā)現(xiàn)應(yīng)用參附注射液組大鼠腸黏膜病理改變較腹腔感染組有明顯好轉(zhuǎn)，黏膜水腫、上皮壞死等情況減輕，并且內(nèi)毒素水平也較腹腔感染組降低，提示參附注射液可能具有腸黏膜屏障的保護(hù)作用。王進(jìn)等［6］曾運(yùn)用參附注射液治療內(nèi)毒素所致全身炎癥反應(yīng)綜合征的大鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)參附注射液可以顯著降低NF－κB活性、TNF－α及IL－6水平，減輕肺臟和肝臟病理損傷，而楊仁軒等［7］對(duì)老年髖部圍手術(shù)期患者應(yīng)用參附注射液進(jìn)行治療時(shí)也證實(shí)預(yù)防性使用參附注射液能使血漿內(nèi)毒素顯著減低，增強(qiáng)肝臟的解毒功能，直接促進(jìn)肝臟對(duì)內(nèi)毒素的滅活。在缺血再灌注損傷動(dòng)物模型中，吳洋等［8］研究表明參附注射液能夠激發(fā)血紅素加氧酶(HO－1)的大量生成，抑制誘生型一氧化氮合酶(iNOS)的表達(dá)，清除氧自由基，抑制脂質(zhì)過氧化物產(chǎn)生，維護(hù)腸黏膜屏障的作用。結(jié)合以往的研究結(jié)果，筆者提出參附注射液可能通過降低腹腔感染大鼠血內(nèi)毒素水平，抑制炎癥反應(yīng)及抗氧化應(yīng)激，進(jìn)而起到腸黏膜的保護(hù)作用。

腹腔感染后應(yīng)用參附注射液治療還可能影響熱休克蛋白(heat shock protein－70，HSP－70)的表達(dá)。業(yè)已證明HSP－70是一種分子伴侶，在細(xì)胞的信息傳遞、生長(zhǎng)、分化中具有重要的調(diào)控作用，同時(shí)HSP－70又具有抗原呈遞而起作用，參與細(xì)胞的抗損傷、修復(fù)過程。HSP－70通過抑制NF－κB活化，從而抑制免疫應(yīng)答細(xì)胞內(nèi)炎癥細(xì)胞因子IL－1、IL－2、TNF－α等的轉(zhuǎn)錄，阻斷促炎因子表達(dá)，從而抑制炎癥反應(yīng)［9］。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)腹腔感染組大鼠腸黏膜HSP－70表達(dá)與假手術(shù)組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而參附注射液治療組大鼠HSP－70的表達(dá)較假手術(shù)組和腹腔感染組均高，提示參附注射液可能促進(jìn)腹腔感染大鼠腸黏膜HSP－70的表達(dá)，從而發(fā)揮腸黏膜保護(hù)作用。

在本研究中，我們還觀察到腹腔感染組大鼠的死亡率明顯高于假手術(shù)組，而應(yīng)用參附注射液治療腹腔感染大鼠后，其死亡率較單純應(yīng)用生理鹽水治療的腹腔感染大鼠死亡率低，這一方面可能與應(yīng)用參附注射液治療能降低內(nèi)毒素水平、對(duì)抗內(nèi)毒素性休克，并能改善重癥膿毒血癥時(shí)組織氧代謝有關(guān)，另一方面可能與參附注射液能改善腸系膜微循環(huán)，促進(jìn)腸道黏膜HSP－70的表達(dá)，保護(hù)腸黏膜屏障有關(guān)［10～12］。

綜上所述，本研究的結(jié)果表明應(yīng)用參附注射液治療腹腔感染大鼠，可以降低血清內(nèi)毒素水平，促進(jìn)腸黏膜HSP－70的表達(dá)，保護(hù)腸黏膜屏障，從而降低腹腔所致的死亡率。

1Xia ZY，Liu XY，Zhan LY et al．Ginsenosides compound(shen－fu) attenuates gastrointestinal injury and inhibits inflammatory response after cardiopulmonary bypass in patients with congenital heart disease［J］．J Thorac Cardiovasc Surg，2005，130(2):258－264

2王麗亞，魏影非，杜惠蘭，等．參附注射液對(duì)腸梗阻術(shù)后患兒腸功能恢復(fù)及細(xì)胞免疫、血IL－2、TNF－α水平的影響［J］．中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2003，23(10):744－746

3鮑揚(yáng)，李幼生，黎介壽．一種新型腹腔感染動(dòng)物模型的建立［J］．中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2004，21(1):99－100

4Matsuda H，Hirato J，Kuroiwa M，et al．Histopathological and immunohistochemical study of the enteric innervations among various types of aganglionoses including isolated and syndromic Hirschsprung disease［J］．Neuropathology，2006，26(1):8－23

5Suzuki Y，Lu Q，Xu DZ，et al．Na+，K+－ATPase activity is inhibited in cultured intestinal epithelial cells by endotoxin or nitric oxide［J］．Int J Mol Med．2005，15(5):871－877

6Wang J，Qiao LF，Yang GT．Role of Shenfu injection in rats with systemic，inflammatory response syndrome［J］．Chin J Integr Med，2008，14(1):51－55

7楊仁軒，郭玉海，李念虎，等．參附注射液對(duì)老年髖部手術(shù)后腸屏障的保護(hù)機(jī)制［J］．中醫(yī)正骨，2005，17(12):8－9

8吳洋，夏中元．參附注射液對(duì)腸缺血再灌注大鼠腎組織HO－1與iNOS表達(dá)的影響［J］．中華中醫(yī)藥雜志，2010，25(7):1024－1027

9Chan JY，Ou CC，Wang LL，et al．Heat shock protein 70 confers cardiovascular protection during endotoxemia via inhibition of nuclear factor－kappaB activation and inducible nitric oxide synthase expression in the rostral vent rolateral medulla［J］．Circulation，2004，110(23): 3560－3566

10王龍，劉先義，陳雪君，等．參附注射液對(duì)休克復(fù)蘇時(shí)腸黏膜保護(hù)作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究［J］．中國(guó)急救醫(yī)學(xué)，2001，21(8):447－448

11江榮林，雷澍，王靈聰，等．參附注射液對(duì)重度膿毒癥患者組織氧代謝的影響［J］．中華中醫(yī)藥雜志，2009，24(7):965－967

12宋欣偉，駱永忠．不同劑量參附注射液對(duì)兔心肌缺血再灌注損傷時(shí)胃腸微循環(huán)的保護(hù)作用［J］．中國(guó)臨床康復(fù)，2005，9(11):128－129

(收稿:2011－12－29)

(修回:2012－02－16)

Effects of Shenfu Injection on the Serum Endotoxin Level，HSP－70 Expression of Intestinal Mucosa in Rats with Severe Abdominal Infection．

Hu Peiyang，Hu Xiaofei，Tu Weiwei，Chen Zhongming，He Lusha，Wang Guo．VIP Ward，Taizhou Hospital，Zhejiang 317000，China

ObjectiveTo study the effects of Shenfu injection on the serum endotoxin levels，the expression of HSP－70 and intestinal mucosal barrier function in rats with severe abdominal infection．MethodsA total of 60 male SD rats were randomly divided into three groups(n=20 each):control group(1aparotomy only)，infection group(cecal ligadon plus puncture)，and Shenfu group［intravenous injection of Shenfu after cecal ligadon plus puncture，10ml/(kg·d)］．Serum endotoxin levels and the expression of HSP－70 in the intestinal mucosa were measure on the fifth day after the operation．The mortality rate and intestinal pathology Chiu scores were calculated meanwile．ResultsOf the three groups，infection group got the highest mortality，while Shenfu injection can reduce mortality(P＜0.05)．Compared with infection group，serum endotoxin level in the Shenfu injection group was significantly lower(P＜0．05)，the expression of HSP－70 in the intestinal mucosa was significantly increased，and Shenfu injection group got better Chiu's scores(P＜0．05)．ConclusionShenfu injection can reduce the serum endotoxin level，promote the expression of intestinal HSP－70 and protect the intestinal mucosal barrier function in rats with severe abdominal infection，therefore it may play a role in reducing the mortality of rats with abdominal infection．

Shenfu injection;SD rats;Endotoxin;Intestinal mucosal barrier;Heat shock protein－70

嚴(yán)重腹腔感染可引起腸黏膜屏障損傷，腸道細(xì)菌、內(nèi)毒素易位，導(dǎo)致感染性休克甚至多器官功能障礙(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)，其病死率約為20%～40%。目前嚴(yán)重腹腔感染的治療仍是腹部外科中棘手的問題。參附注射液(shenfu injection，SF)為紅參、黑附片提取物的制劑，主要成分是人參皂貳、烏頭類生物堿，中醫(yī)認(rèn)為其具回陽救逆、益氣固脫的作用，主要用于暴脫的厥脫癥(感染性、失血性、失液性休克等)?，F(xiàn)代藥理學(xué)認(rèn)為參附注射液具有抗炎、抗休克、抗氧自由基、改善微循環(huán)、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能等多種藥理作用。研究提示參附注射液對(duì)腸黏膜缺血再灌注損傷及重要臟器具有一定的保護(hù)作用，并能夠促進(jìn)腸梗阻患兒術(shù)后腸功能及免疫功能的恢復(fù)，但其在嚴(yán)重腹腔感染中的治療作用及機(jī)制尚未見文獻(xiàn)報(bào)道［1，2］。本研究通過復(fù)制SD大鼠嚴(yán)重腹腔感染模型，檢測(cè)血清內(nèi)毒素水平和腸黏膜細(xì)胞熱休克蛋白－70(heat shock protein－70，HSP－70)表達(dá)，評(píng)估腸黏膜損傷程度來探討參附注射液在嚴(yán)重腹腔感染的治療作用。

317200浙江省天臺(tái)人民醫(yī)院(胡培陽);317000臨海，浙江省臺(tái)州醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(胡曉飛);急診科(屠巍巍、陳中明); 311800浙江省諸暨市紅十字醫(yī)院急診科(何露莎);浙江省臺(tái)州醫(yī)院特需病房(王果)

胡曉飛，電子信箱:huxiaofei2008@hotmail．com