高糖環(huán)境下exendin－4對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞CTGF、BMP－7表達(dá)的影響

張繼敏 蘭麗 珍孔瑜

高糖環(huán)境下exendin－4對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞CTGF、BMP－7表達(dá)的影響

張繼敏 蘭麗 珍孔瑜

目的探討exendin－4對(duì)高糖環(huán)境下人腎小管上皮細(xì)胞(HK－2)結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白－7 (BMP－7)蛋白和mRNA表達(dá)的影響。方法將體外培養(yǎng)的HK－2細(xì)胞分為正常糖對(duì)照組(NG)、高糖組(HG)、甘露醇組(MG)、高糖+不同濃度的exendin－4組(分別exendin－4 10、20、40pmol/L)，于培養(yǎng)48h后，采用免疫細(xì)胞化學(xué)、RT－PCR方法檢測(cè)HK－2細(xì)胞CTGF、BMP－7蛋白和mRNA表達(dá)量。結(jié)果與NG相比，HG組HK－2細(xì)胞CTGFmRNA和蛋白表達(dá)明顯升高(P＜0．05)，BMP－7 mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低(P＜0．05)，加入exendin－4的各組HK－2細(xì)胞CTGF表達(dá)較HG組均明顯降低(P＜0．05)，BMP－7的表達(dá)較HG組均明顯升高(P＜0．05)。結(jié)論exendin－4可能會(huì)通過抑制高糖環(huán)境下HK－2細(xì)胞CTGF高表達(dá)，提高BMP－7的表達(dá)，改善糖尿病腎病。

胰高血糖素樣肽－1exendin－4人腎小管上皮細(xì)胞結(jié)締組織生長(zhǎng)因子骨形態(tài)發(fā)生蛋白－7

材料與方法

1．材料:(1)細(xì)胞株:人腎臟近端小管上皮細(xì)胞株(HK－ 2)購(gòu)自中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞中心。(2)實(shí)驗(yàn)藥物與主要試劑:exendin－4(東莞寶麗健生物工程研究開發(fā)有限公司);胎牛血清、DMEM低糖和高糖培養(yǎng)基(HyClone公司);二甲基亞砜(美國(guó)Sigma公司);胰蛋白酶－EDTA消化液(北京索萊寶科技有限公司)。兔抗BMP－7多克隆抗體、兔抗CTGF多克隆抗體、DAB顯色劑(武漢博士德公司)，TRIzolRNA提取試劑盒(Invitrogen公司)、PCR引物(上海生物工程有限公司);反轉(zhuǎn)錄(RT)試劑盒(Fermentas公司)，熒光定量PCR試劑(Roche公司)。(3)實(shí)驗(yàn)主要儀器:CO2恒溫培養(yǎng)箱(日本SANYO公司);生物凈化工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司);倒置顯微鏡(重慶光電儀器總公司);BI－2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司);熒光定量PCR儀TL988(西安天隆科技有限公司)。

2．方法:(1)細(xì)胞培養(yǎng)及分組:HK－2細(xì)胞系用含10%滅活胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)液(D－葡萄糖濃度5.5mmol/L)于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，每2～3天更換1次培養(yǎng)液，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%時(shí)更換為無血清DMEM培養(yǎng)液，使細(xì)胞生長(zhǎng)同步化24h。將細(xì)胞分為以下各組:①正常糖對(duì)照組(NG組含5．5mmol/L D－葡萄糖);②高糖組(HG組含30mmol/L D－葡萄糖);③甘露醇組(MG組含24．5mmol/L甘露醇和5．5mmol/L D－葡萄糖，終濃度為30mmol/L);④HG+不同濃度exendin－4干預(yù)組(HG+exendin－4組)，exendin－4終濃度分別為10、20、40pmol/L。48h后取樣觀察，每組均含3瓶細(xì)胞(n=3)。(2)免疫細(xì)胞化學(xué)染色:按實(shí)驗(yàn)分組條件于6孔板中培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞爬片經(jīng)PBS洗滌后用4%多聚甲醛固定，0．1%TritonX－100打孔，5%BSA封閉，然后用一抗為兔抗BMP－7多克隆抗體(1∶50，武漢博士德公司)，兔抗CTGF多克隆抗體(1∶100，武漢博士德公司)，4℃孵育過夜，PBS緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照。第2天滴加生物素化山羊抗兔IgG，37℃孵育30min，DAB顯色。蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，中性樹膠封片，拍照。圖像用BI－2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，隨機(jī)不重復(fù)選取10個(gè)高倍視野，測(cè)陽性細(xì)胞的平均光密度值。(3)RT－PCR法檢測(cè)各組HK－2細(xì)胞中BMP－7、CTGFmRNA表達(dá):收集細(xì)胞，加入1mlTrizol提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA進(jìn)行PCR反應(yīng)，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明操作，內(nèi)參為人的β－actin。PCR引物序列:β－actin擴(kuò)增片段為184bp，上下游引物分別為5'－AGAGCTACGAGCTGCCTGAC－3'和5'－AGCACTGTGTTGGCGTACAG－3';CTGF擴(kuò)增片段為153bp，上下游引物分別為5'－GGAAAAGATTCCCACCCAAT－3'和5'－TGCTCCTAAAGCCACACCTT－3';BMP－7擴(kuò)增片段為133bp，上下游引物分別為5－TTTTCTGGATCCTCCATTGC－3'和5'－CAAAAGCCATATGCTGCTCA－3'。反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性10min;94℃變性15s，58℃退火60s，45個(gè)循環(huán)結(jié)束。重復(fù)3次獨(dú)立的RTPCR全過程。熒光定量TL988PCR儀進(jìn)行定量分析，目的基因擴(kuò)增用CT值，首先計(jì)算各樣本測(cè)定基因X:CT與內(nèi)對(duì)照基因β－actin CT的差值，即ΔCT=CT(X)－CT(β－actin)，再用各實(shí)驗(yàn)組樣本的ΔCT減去正常對(duì)照組樣本的ΔCT，得到ΔΔCT，利用2－ΔΔCT計(jì)算基因表達(dá)情況。

3．統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:全部數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 17．0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示，用單因素方差分析進(jìn)行分析，兩兩比較用LSD－t多重比較，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。如果資料不符合正態(tài)分布，則采用非參數(shù)檢驗(yàn)。

結(jié)果

1．各組細(xì)胞CTGF、BMP－7蛋白表達(dá)水平:HK－2細(xì)胞陽性染色為胞質(zhì)呈黃色至棕黃色顆粒狀，陰性胞質(zhì)為淡紫藍(lán)色，胞核為藍(lán)色。結(jié)果顯示:NG組和MG組，CTGF有弱陽性信號(hào)表達(dá)，BMP－7有陽性信號(hào)表達(dá);HG組，CTGF陽性表達(dá)較NG組和MG組顯著增加(P＜0．05)，BMP－7陽性表達(dá)顯著降低(P＜0．05);與HG組相比，HG+不同濃度exendin－4組CTGF陽性表達(dá)均明顯降低(P＜0．05)，BMP－7陽性表達(dá)均明顯升高(P＜0．05)，且都呈濃度依賴性，但HG+不同濃度exendin－4組的CTGF、BMP－7陽性表達(dá)水平均未恢復(fù)到NG組水平(P＜0．05，表1及圖1、圖2)。

表1 各組腎小管上皮細(xì)胞CTGF、BMP－7的平均光密度±s)

表1 各組腎小管上皮細(xì)胞CTGF、BMP－7的平均光密度±s)

與NG組相比較，*P＜0．05;與HG組相比較，#P＜0．05;多重比較，ΔP＜0．05

組別CTGFBMP－7 NG0．191±0．0180．321±0．009 MG0．187±0．0160．320±0．017 HG0．378±0．018*0．213±0．021* HG+exendin－4 10pmol/L0．332±0．017*#Δ0．237±0．017*#Δ 20pmol/L0．289±0．010*#Δ0．269±0．015*#Δ 40pmol/L0．234±0．020*#Δ0．304±0．015*#Δ

2．各組細(xì)胞CTGF及BMP－7mRNA表達(dá)水平: NG組和MG組，CTGFmRNA有微量水平的表達(dá)，BMP－7mRNA高表達(dá);HG組CTGFmRNA表達(dá)較NG組明顯升高(P＜0．05)，BMP－7mRNA表達(dá)較NG組明顯下降(P＜0．05)，與HG組相比，HG+exendin－4(10pmol/L)組、HG+exendin－4(20pmol/L)組、HG +exendin－4(40pmol/L)組HK－2細(xì)胞CTGFmRNA表達(dá)均下調(diào)(P＜0．05)，BMP－7mRNA表達(dá)均上調(diào)(P＜0．05)，且均呈濃度依賴性，但都沒有恢復(fù)到NG組水平(表2)。

表2 各組腎小管上皮細(xì)胞CTGF及BMP－7mRNA的2﹣ΔΔCT(n=3±s)

表2 各組腎小管上皮細(xì)胞CTGF及BMP－7mRNA的2﹣ΔΔCT(n=3±s)

與NG組比較，*P＜0．05;與HG組比較，#P＜0．05;多重比較，ΔP＜0．05

組別CTGFBMP－7 NG11 MG0．972±0．2290．955±0．182 HG6．163±0．161*0．183±0．040* HG+exendin－4 10pmol/L4．486±0．285*#Δ0．286±0．048*#Δ 20pmol/L3．181±0．244*#Δ0．415±0．036*#Δ 40pmol/L2．001±0．378*#Δ0．602±0．117*#Δ

討論

腎間質(zhì)纖維化是多種原因引起的慢性腎臟疾病進(jìn)展為腎衰竭的共同通路，腎小管上皮損傷后的病理改變是腎間質(zhì)纖維化的始動(dòng)因素［3］。在糖尿病持續(xù)高血糖狀態(tài)下，尿糖的產(chǎn)生及腎小管間質(zhì)組織和周圍血管中葡萄糖濃度的升高，誘導(dǎo)腎小管細(xì)胞凋亡，促使小管萎縮，進(jìn)而發(fā)展為腎小管纖維化。它的形成是一個(gè)多因素、多細(xì)胞參與的復(fù)雜過程，尤其是促纖維化因子和抗纖維化因子的失衡。

CTGF是一種新發(fā)現(xiàn)的具有多種功能的細(xì)胞因子，多種腎組織細(xì)胞均可分泌，近年，隨著對(duì)CTGF結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能的深入研究，CTGF在DN腎間質(zhì)纖維化的作用越來越重要。CTGF是轉(zhuǎn)化生子因子－β (transforming growth factor－β，TGF－β)發(fā)揮其致纖維化效應(yīng)的下游因子，它不僅引起腎小球硬化，還可促進(jìn)腎小管間質(zhì)纖維化［4］。研究發(fā)現(xiàn)鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎組織中CTGF蛋白和mRNA表達(dá)水平均明顯升高［5］。Umezono等［6］利用原位雜交方法觀察DN患者腎活檢標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)在腎間質(zhì)小管萎縮和間質(zhì)纖維化區(qū)域CTGFmRNA表達(dá)較高，且與纖維化程度有關(guān)。這些均提示CTGF在糖尿病腎病腎小管間質(zhì)纖維化發(fā)展過程中是一個(gè)關(guān)鍵性致病因子。本研究表明在高糖刺激下，HK－2細(xì)胞CTGF蛋白及mRNA表達(dá)明顯增加。甘露醇組與低糖組相比，CTGF表達(dá)無明顯變化，說明該作用與高糖所導(dǎo)致的高滲透壓無關(guān)。exendin－4干預(yù)組CTGF的表達(dá)均較高糖組明顯減少。有研究表明，exendin－4可通過作用于腎臟的GLP－1受體抑制TGF－β的表達(dá)，改善糖尿病腎?。?］。由此可推測(cè)，exendin－4可能通過抑制TGF－β，進(jìn)而阻止其發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的下游因子CTGF的表達(dá)，改善高糖所致腎間質(zhì)纖維化。

BMP－7是新發(fā)現(xiàn)的腎臟內(nèi)分泌激素，屬于TGF－β細(xì)胞因子超家族，在抗腎間質(zhì)纖維化中扮演著重要的角色，是一種有效的腎臟保護(hù)因子。BMP－7主要表達(dá)于腎臟遠(yuǎn)端小管和集合管，在近段小管有少量表達(dá)。腎臟疾病時(shí)，BMP－7可通過抑制上皮細(xì)胞的凋亡、促進(jìn)腎間質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解、減少促炎癥因子釋放、對(duì)抗TGF－β1的致腎纖維化作用來保護(hù)腎臟。同時(shí)，BMP－7還可通過促進(jìn)E－鈣黏蛋白的重新表達(dá)，促使間質(zhì)細(xì)胞向正常上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，恢復(fù)腎臟正常結(jié)構(gòu)和功能［8］。本研究結(jié)果表明在低糖組HK－2細(xì)胞中BMP－7mRNA和蛋白有少量表達(dá)［9，10］。與正常糖組相比，高糖作用下的腎小管上皮細(xì)胞BMP－7蛋白及mRNA表達(dá)明顯降低。體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)p38MAPK信號(hào)通路可能參與介導(dǎo)高糖刺激腎小管上皮細(xì)胞BMP－7表達(dá)的下調(diào)。在exendin－4組，腎小管上皮細(xì)胞BMP－7蛋白及mRNA表達(dá)較高糖組均明顯上調(diào)［11］。至于exendin－4通過何種途徑介導(dǎo)BMP－7表達(dá)增加有待進(jìn)一步研究。其結(jié)果表明exendin－4可通過上調(diào)BMP－7的表達(dá)發(fā)揮對(duì)腎臟的保護(hù)作用，從而對(duì)DN腎小管間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展起到預(yù)防及逆轉(zhuǎn)作用。

本研究結(jié)果提示，exendin－4可能會(huì)通過抑制腎組織CTGF的過度表達(dá)和升高腎組織BMP－7的表達(dá)，來延緩糖尿病腎病腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)展，為今后運(yùn)用GLP－1治療DN提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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(收稿:2012－01－04)

(修回:2012－02－16)

Effect of Exendin－4 on the Expression of Connective Tissue Growth Factor(CTGF)and Bone Morphogenetic Protein－7(BMP－7)in Human Renal Tubular Epithelial Cell Cultured with High Concentration of D－glucose．

Zhang Jimin，Lan Lizhen，Kong Yu．Department of Endocrinology，The First Clinical Medical College，Shanxi Medical University，Shanxi 030001，China

ObjectiveTo investigate the effect of exendin－4 on the expression of connective tissue growth factor(CTGF)and bone morphogenetic protein－7(BMP－7)in human renal tubular epithelial cell cultured in high－glucose environment．MethodsHK－2 cells were subcultured under normal glucose(NG)，high glucose(HG)，mannitol glucose(MG)and high glucose with different concentrations of exendin－4 group(including exendin－4 10，20，40pmol/L)．The activity of CTGF and the expressions of BMP－7 protein and mRNA in cultured HK－2 cells were detected with immunocytochemistry and RT－PCR at 48h．ResultsCompared with the normal group，the expression of CTGF significantly increased in the high glucose group(P＜0．05)，the expression of BMP－7 significantly decreased in the high glucose group(P＜0．05)．Compared with the high glucose group，the expressions of CTGF was significantly lower in all the exendin－4 groups(P＜0．05)，the expressions of BMP－7 significantly increased in all the exendin－4 groups(P＜0．05)．ConclusionExendin－4 may modulate the process of diabetic nephropathy by inhibiting the expression of CTGF and increasing the expression of BMP－7 in high glucose－induced HK－2 cells．

Glucogon like peptide－1;Exendin－4;Human renal tubular epithelial cell;Connective tissue growth factor;Bone morphogenetic protein－7

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病主要微血管并發(fā)癥之一，目前DN發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，以往對(duì)糖尿病腎病的研究多在腎小球方面，近年，腎小管上皮細(xì)胞在糖尿病腎病中的作用越來越引起人們的重視。就對(duì)腎功能的影響程度而言，腎小管病變較腎小球病變更為突出，且腎小管間質(zhì)纖維化程度與腎功能衰竭的程度密切相關(guān)［1，2］。胰高血糖素樣肽－1(glucogon like peptide－1，GLP－1)是由腸道L細(xì)胞分泌的一種腸促胰島素，GLP－1受體廣泛分布于嚙齒類動(dòng)物和人體內(nèi)。exendin－4是從生活在美國(guó)西南部的希拉毒蜥的唾液中分離出來的GLP－1類似物，在胰島GLP－1受體介導(dǎo)下發(fā)揮調(diào)節(jié)血糖作用，屬于GLP－1受體激動(dòng)劑。近年來，人們對(duì)GLP－1的研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)腎臟具有保護(hù)作用，但對(duì)于GLP－1的腎臟保護(hù)作用是否與調(diào)節(jié)CTGF、BMP－7的表達(dá)有關(guān)，目前國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道較少。本文旨在研究GLP－1類似物exendin－4對(duì)高糖條件下腎小管上皮細(xì)胞CTGF和BMP－7表達(dá)的影響，為糖尿病腎小管間質(zhì)纖維化的防治提供一個(gè)新的途徑。

030001太原，山西醫(yī)科大學(xué)(張繼敏、孔瑜);山西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科(蘭麗珍)

蘭麗珍，電子信箱:lanlizhen@163．com