水酶法提取油茶籽油的工藝優(yōu)化及其營養(yǎng)成分分析

劉瑞興 張智敏 吳蘇喜 黃閃閃

(長沙理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，長沙 410114)

油茶(Camellia oleifera Abel.)是我國特有的木本油料樹種，也是世界四大食用木本油料樹種之一［1］。經(jīng)測試，油茶籽油的油酸及亞油酸含量均高于橄欖油，物理化學(xué)特性也與橄欖油非常相似［2］。油茶籽油中還含有豐富的VE、VD、胡蘿卜素、磷脂、角鯊烯等其他生物活性成分，長期食用后具有明顯的預(yù)防各種心腦血管疾病、延緩動脈粥樣硬化降血壓、降血脂等功效［3－5］，是一種優(yōu)質(zhì)的保健食用油。脫脂去皂后的餅粕還含有14%的粗蛋白，25%的粗脂肪，都是很重要的工業(yè)原料［6］。

油茶籽油傳統(tǒng)制取方法主要為壓榨法和浸出法。水酶法作為一種新興的植物油脂提取技術(shù)，與傳統(tǒng)方法相比，具有操作溫度低，能耗低，提取的油純度高，磷脂含量、酸值及過氧化值低，色澤淺，污染少的優(yōu)點(diǎn)，符合“安全、高效、綠色”的要求［7－9］。目前，油茶籽油的水酶法制取方面國內(nèi)還處于起步階段［10－11］。本試驗(yàn)將超聲波輔助技術(shù)應(yīng)用到油茶籽油的酶法提取中，摸索影響出油效率的工藝條件，同時對酶法提油茶籽油的酸值、過氧化值、苯并(α)芘以及VE、角鯊烯、不飽和脂肪酸等含量進(jìn)行了分析測定，以揭示酶法提取工藝對油茶籽油營養(yǎng)品質(zhì)、衛(wèi)生品質(zhì)及理化性質(zhì)的影響，為油茶籽油綜合開發(fā)利用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油茶籽:2010年購自農(nóng)戶;30－60石油醚:國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;硫酸、鹽酸:衡陽市凱信化工試劑有限公司;氫氧化鈉:西隴化工股份有限公司;無水乙醇、無水乙醚(分析純):衡陽市凱信化工試劑有限公司;抗壞血酸:天津市化學(xué)試劑一廠;維生素E標(biāo)準(zhǔn)品:美國Supelco公司;3，4－苯并(α)芘標(biāo)準(zhǔn)品(99%):Sigma;角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品(純度99%):北京恒元啟天化工技術(shù)研究院;中性蛋白酶NCB－A5、纖維素酶AE80、果膠酶、α－淀粉酶:湖南尤特爾生化有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

SHA－B恒溫水浴振蕩器:江蘇金壇市金城國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠;UV754紫外可見分光光度計(jì):上海精密科學(xué)儀器有限公司;GC－14C氣相色譜儀(FID檢測器)、LC－20AT高效液相色譜儀(紫外檢測器，C18色譜柱)、AUY120電子分析天平(0.0001 g):日本島津公司;KQ3200DA超聲波清洗器:昆山市超聲儀器有限公司;MAXI－MIXⅡ渦旋混合器:美瑞泰克科技有限公司;RE－52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器:上海雅榮生化設(shè)備儀器有限公司;DELTA 320 pH計(jì):梅特勒－托利多儀器(上海)有限公司;JJ－1型定時電動攪拌器:江蘇金壇市金城國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠;LD5－10臺式離心機(jī):北京京立離心機(jī)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 油茶籽仁主要成分測定

水分測定:GB/T 5497—1985 105℃恒重法;粗脂肪測定:GB/T 14772—2008索氏抽提法;粗蛋白測定:GB/T 14489.2—1993凱氏法;淀粉含量的測定:GB/T 5514—2008糧油檢驗(yàn) 糧食、油料中淀粉含量測定;茶皂素含量的測定:參考文獻(xiàn)［12］。

1.3.2 水酶法制取油茶籽油的工藝流程

油茶籽→干燥→去殼→粉碎→40目篩下物→加緩沖溶液→90℃水浴加熱30 min→調(diào)節(jié)pH和溫度→加酶→反應(yīng)→滅酶→破乳→離心分離→取上層清油→干燥至恒重→油茶籽油 ↓

測蛋白水解率←干燥至恒重←殘?jiān)?/p>

1.3.3 單因素試驗(yàn)

取20 g去殼粉碎后過20目的油茶籽，依照1.3.2工藝，分別研究超聲時間、加熱預(yù)處理時間、加熱預(yù)處理溫度、酶的種類、料液比、加酶量、酶解pH、酶解溫度和酶解時間對油茶籽水酶法出油效率的影響。試驗(yàn)重復(fù)1次。

1.3.4 優(yōu)化試驗(yàn)

多因素試驗(yàn)采用Box－Behnken設(shè)計(jì)，利用響應(yīng)曲面法進(jìn)行分析優(yōu)化［13－14］。

1.3.5 油茶籽油中苯并(α)芘的測定［15］

采用反相高效液相色譜法對苯并(α)芘進(jìn)行測定。其色譜條件如下:保護(hù)柱為Phenomenex C18(5 μm，4 mm ×3.0 mm);色譜柱:島津 inertsil ODS －SP C18 柱(5 μm，4.6 mm ×250 mm);流動相:乙腈/水(90/10);流速:1.0 mL/min;激發(fā)波長 384 nm，發(fā)射波長406 nm;柱溫:35 ℃;進(jìn)樣量:10 μL。

1.3.6 油脂理化指標(biāo)及主要營養(yǎng)成分分析方法

1.3.6.1 理化指標(biāo)

酸價(jià):參考GB/T 5530—2005動植物油脂酸值和酸度測定;過氧化值:參照GB/T 5538—2005油脂過氧化值測定;色澤:參考GB/T 22460—2008動植物油脂羅維朋色澤的測定;水分及揮發(fā)物含量:參照GB/T 5528—2008電烘箱105℃恒質(zhì)量法;透明度、氣味、滋味:參照GB/T 5525—2008感官鑒定法;VE:參照 GB/T 5009.82—2003;脂肪酸:參考文獻(xiàn)［16］。

1.3.6.2 角鯊烯的測定

色譜柱:ZB －5(30 m ×0.25 mm ×0.25 μm);升溫程序:初溫180℃，以10℃/min升溫至280℃，保持20 min;進(jìn)樣口溫度:290℃;檢測器溫度:300℃;載氣:高純氮?dú)?載氣流速:2 mL/min;進(jìn)樣方式:不分流進(jìn)樣;進(jìn)樣量:1 μL。

角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)儲備液:精密稱取角鯊烯10 mg置10 mL容量瓶中，加正己烷適量，振搖，使角鯊烯溶解后，再加正己烷至刻度，搖勻，為1 mg/mL的角鯊烯儲備液。

角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)系列溶液:取適量的1 mg/mL的角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)儲備液用正己烷依次梯度稀釋成濃度為40、80、120、160、200 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)液。

樣品的制備:精確稱取油樣約 0.200 0 g，于1.5 mL的離心管中，用正己烷定容到1 mL，搖勻，待氣相色譜檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 油茶籽仁主要成分

表1 油茶籽仁主要成分含量/%

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 酶的種類

固定加酶量為1%(復(fù)合酶為蛋白酶0.5%+纖維素酶0.5%)，料液比為1∶5，加熱預(yù)處理時間為20 min，加熱預(yù)處理溫度為90℃，超聲時間為20 min，酶解pH 6.9，酶解溫度為55℃，酶解時間為5 h，分別使用不同種類的酶在同等條件下進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)果如圖1所示。

圖1 酶的種類對出油效率的影響

由圖1可知，蛋白酶對出油效率影響最大，而破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的纖維素酶和果膠酶次之，效果最不明顯的為α－淀粉酶，蛋白酶與纖維素酶的共同作用能夠顯著提高出油效率。這說明，經(jīng)過超聲波和加熱預(yù)處理的破壁作用后，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)已經(jīng)一定程度地松解，影響油脂釋放的主要因素為與油脂結(jié)合的脂蛋白，因此加入少量纖維素酶或果膠酶繼續(xù)降解細(xì)胞壁骨架，再加入蛋白酶水解蛋白后，油脂就能夠得到有效地釋放，從而提高出油效率。

2.2.2 加酶量

固定酶種類為復(fù)合酶(蛋白酶∶纖維素酶=4∶1)，料液比為1∶5，加熱預(yù)處理時間為20 min，加熱預(yù)處理溫度為90℃，超聲時間為20 min，酶解pH 6.9，酶解溫度為55℃，酶解時間為5 h，分別加入不同用量的酶(占油茶籽原料質(zhì)量的百分比)在同等條件下進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)果如圖2所示。

圖2 加酶量對出油效率的影響

由圖2可知，加酶量在2.5%(占油茶籽原料質(zhì)量)以內(nèi)，隨著酶用量的增加，出油效率呈上升趨勢，2.5%以后，出油效率稍微降低，然后趨于恒定。因此加酶量為2.5%。

2.2.3 加熱預(yù)處理時間

固定酶種類為復(fù)合酶(蛋白酶∶纖維素酶 =4∶1)，加酶量為 2.5%，料液比為 1∶5，加熱預(yù)處理溫度為90℃，超聲時間為20 min，酶解pH 6.9，酶解溫度為55℃，酶解時間為5 h，改變加熱預(yù)處理時間，在同等條件下進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)果如表2及圖3所示。

表2 加熱預(yù)處理時間對出油效率的影響

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，蒸汽預(yù)處理是為了使油茶籽的脂肪酶失活，同時使細(xì)胞壁疏松，增加滲透性和便于酶的作用，使油更容易釋放出來［17］。

由圖3可知，蒸汽處理時間在20 min內(nèi)，延長蒸汽處理時間，出油效率有所提高，但變化緩慢，處理時間超過20 min，則出油效率開始下降。分析原因可能是常壓蒸汽處理有利于植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)變得松弛，使得酶易于進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部發(fā)生作用，從而提高出油效率，但是蒸汽處理時間過長，會產(chǎn)生乳化現(xiàn)象，出油效率反而下降。最后選定蒸汽處理時間為20 min。

圖3 加熱預(yù)處理時間對出油效率的影響

2.2.4 加熱預(yù)處理溫度

固定酶種類為復(fù)合酶(蛋白酶∶纖維素酶=4∶1)，加酶量為 2.5%，料液比為 1∶5，加熱預(yù)處理時間為20 min，超聲時間為20 min，酶解 pH 6.9，酶解溫度為55℃，酶解時間為5 h，改變加熱預(yù)處理溫度，在同等條件下進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)果如表3及圖4所示。

表3 加熱預(yù)處理溫度對出油效率的影響

圖4 加熱預(yù)處理溫度對出油效率的影響

由圖4可知加熱預(yù)處理溫度在90℃以內(nèi)，隨著溫度的升高，出油效率呈上升趨勢，90℃以上，出油效率急劇降低，原因可能是較高溫度導(dǎo)致油脂被破壞，從而使出油效率下降。因此選定加熱預(yù)處理溫度為90℃。

2.2.5 超聲時間

固定酶種類為復(fù)合酶(蛋白酶∶纖維素酶 =4∶1)，加酶量為 2.5%，料液比為 1∶5，加熱預(yù)處理時間為20 min，加熱預(yù)處理溫度為90℃，酶解pH 6.9，酶解溫度為55℃，酶解時間為5 h，改變超聲時間，在同等條件下進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)果如圖5所示。

圖5 超聲時間對出油效率的影響

由圖5可知，0～20 min內(nèi)，隨著超聲時間的增長，出油效率增大，20 min后，出油效率急劇減小，分析原因是超聲時間過長，油脂出現(xiàn)明顯的乳化作用，降低了出油效率。因此，選定超聲時間為20 min。

2.2.6 料液比

固定酶種類為復(fù)合酶(蛋白酶∶纖維素酶 =4∶1)，加酶量為 2.5%，超聲時間為 20 min，加熱預(yù)處理時間為20 min，加熱預(yù)處理溫度為90℃，酶解pH 6.9，酶解溫度為55℃，酶解時間為5 h，改變料液比，在同等條件下進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)果如圖6所示。

圖6 料液比對出油效率的影響

由圖6可知，料液比高于1∶5時，水過少，不利于酶解，當(dāng)料液比低于1∶5時，水的增多，導(dǎo)致出油效率降低，因此選定料液比為1∶5(即5 mL/g)。

2.2.7 酶解 pH

固定酶種類為復(fù)合酶(蛋白酶∶纖維素酶 =4∶1)，加酶量為 2.5%，料液比為 1∶5，超聲時間為 20 min，加熱預(yù)處理時間為20 min，加熱預(yù)處理溫度為90℃，酶解溫度為55℃，酶解時間為5 h，改變酶解pH，在同等條件下進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)果如圖7所示。

圖7 酶解pH對出油效率的影響

復(fù)合酶以蛋白酶的用量居多，因此出油效率主要受蛋白酶活性的pH影響，由圖7可知，在復(fù)合酶的共同作用下，酶解pH 6.5時，出油效率最高。

2.2.8 酶解溫度

固定酶種類為復(fù)合酶(蛋白酶∶纖維素酶 =4∶1)，加酶量為 2.5%，料液比為 1∶5，超聲時間為 20 min，加熱預(yù)處理時間為20 min，加熱預(yù)處理溫度為90℃，酶解pH 6.9，酶解時間為5 h，改變酶解溫度，在同等條件下進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)果如圖8所示。

圖8 酶解溫度對出油效率的影響

復(fù)合酶以蛋白酶的用量居多，因此出油效率主要受蛋白酶活性的溫度影響，由圖8可知，在復(fù)合酶的共同作用下，酶解溫度為50℃時，出油效率最高。

2.2.9 酶解時間

固定酶種類為復(fù)合酶(蛋白酶∶纖維素酶 =4∶1)，加酶量為 2.5%，料液比為 1∶5，超聲時間為 20 min，加熱預(yù)處理時間為20 min，加熱預(yù)處理溫度為90℃，酶解pH 6.9，酶解溫度為55℃，改變酶解時間，在同等條件下進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)果如圖9所示。

由圖9可知，反應(yīng)5 h以內(nèi)，出油效率隨著時間的增長而明顯增大，5 h后，出油效率反而下降，因此酶解時間以5 h為宜。

通過單因素試驗(yàn)得到水酶法提取油茶籽油的最佳條件:超聲時間20 min，加熱預(yù)處理90℃、20 min，加酶量2.5%(考慮到蛋白酶作用最大，而且其質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于2%時，提油效果顯著，于是將蛋白酶、纖維素酶用量配比定為 4∶1)，料液比 1∶5，酶解pH 6.5，酶解溫度50℃，酶解時間5 h。

圖9 酶解時間對出油效率的影響

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在預(yù)做試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選取料液比、加酶量、酶解 pH、酶解溫度，用 Design expert軟件中的Box－Behnken模型進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)［18－20］，以出油效率(Y)為評價(jià)指標(biāo)。響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)的因素水平表見表4，試驗(yàn)方案及結(jié)果見表5。

表4 響應(yīng)面因素水平表

表5 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果

續(xù)表

2.3.1 不同因素對出油效率的影響

由表5試驗(yàn)結(jié)果得到出油效率(Y)與料液比(X1)、加酶量(X2)、酶解pH(X3)和酶解溫度(X4)之間的二次多元回歸模型:

利用統(tǒng)計(jì)分析軟件Design expert對表5試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表6。

表6 回歸方程的方差分析

由表6可知，料液比、加酶量、酶解溫度、加酶量的平方、酶解pH的平方、酶解溫度的平方對出油效率的影響極顯著(P＜0.01);加酶量與酶解pH的交互項(xiàng)、料液比的平方對出油效率的影響顯著(P＜0.05);影響因素主次順序?yàn)?加酶量＞酶解溫度＞料液比＞酶解pH。模型的P值＜0.000 1，表明該回歸方程線性極顯著;失擬值為0.153 4(P＞0.05)，失擬不顯著;并且該模型R2=0.963 2，R2Adj=0.926 3，以上均表明該回歸方程擬合程度好。

為了使模型更真實(shí)準(zhǔn)確地反映數(shù)據(jù)實(shí)際情況，將模型進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化后回歸方程的方差分析見表7。

表7 優(yōu)化后回歸方程的方差分析

由表7試驗(yàn)結(jié)果得到萃取得率(Y)與料液比(X1)、加酶量(X2)、酶解pH(X3)和酶解溫度(X4)之間的二次多元回歸模型:

2.3.2 各因素間的交互作用對出油效率響應(yīng)面的分析

利用Design expert軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)回歸擬合，做各因素間交互作用的二次響應(yīng)面分析。

將建立的回歸模型中的任意兩因素固定在零水平，得到另外兩因素的交互影響結(jié)果:二次回歸方程的響應(yīng)面及其等高線見圖10～圖12。等高線表示在同一橢圓形區(qū)域里，出油效率是相同的，在橢圓形區(qū)域中心，出油效率最大，并逐漸向邊緣減少。圖中橢圓排列越密集，表明因素的變化對出油效率影響越大。圖反映出出油效率在各因素的中心點(diǎn)附近可獲得最大值，并且只有加酶量與酶解pH的交互項(xiàng)對出油效率影響顯著，加酶量是影響出油效率的最主要因素。

2.3.3 最佳工藝條件及其驗(yàn)證試驗(yàn)

通過Design expert軟件分析，得出最佳酶解條件為:酶用量2.62%，酶解溫度 52.1 ℃，料液比 1∶5.58，酶解 pH 6.47。在該條件下，出油效率有最優(yōu)值83.6%。

在此條件下進(jìn)行3組平行驗(yàn)證試驗(yàn)的平均得率為83%，與軟件估測值83.6%基本一致，說明響應(yīng)面法優(yōu)化出來的該工藝條件(酶用量2.62%，酶解溫度52.1 ℃，料液比1∶5.58，酶解 pH 6.47)是可行的。

2.3.4 蛋白水解率的測定結(jié)果

將2.3.3驗(yàn)證試驗(yàn)中的3組平行樣品，通過凱氏定氮法分別測定其酶解殘?jiān)拇值鞍缀?，利用公?2)計(jì)算得到水酶法提取油茶籽油的平均蛋白水解率高達(dá)90.4%。說明，水酶法提取植物油的原理之一是靠大量水解油茶籽中的蛋白質(zhì)，導(dǎo)致油茶籽子葉細(xì)胞的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)破裂和包圍著脂質(zhì)體的那些脂蛋白分解，從而使油脂釋放出來［21－23］。

2.4 油茶籽油中苯并(α)芘含量的測定結(jié)果

將2.3.3驗(yàn)證試驗(yàn)中的3組平行樣品制得的油茶籽油分別測定苯并(α)芘的含量，結(jié)果見表8。

表8 水酶法制油茶籽油中的苯并(α)芘含量

由表8可以看出，水酶法提取的油茶籽毛油的苯并(α)芘含量完全在安全范圍內(nèi)(GB 2716—2005中規(guī)定，食用植物油中苯并(α)芘含量的上限值是10 μg/kg)。

2.5 油脂理化指標(biāo)及主要營養(yǎng)成分測定結(jié)果

以優(yōu)化后的最佳酶解條件制得的油茶籽油進(jìn)行理化指標(biāo)測定及主要營養(yǎng)成分測定，結(jié)果見表9。

表9 水酶法制油茶籽油的理化指標(biāo)及主要營養(yǎng)成分

由表9可以看出，該毛油的色澤、氣味和滋味、酸價(jià)、過氧化值等理化指標(biāo)均已達(dá)到國家壓榨一級油茶籽油的標(biāo)準(zhǔn)要求［24］，可以不經(jīng)過完全精煉。水酶法制取的油茶籽油中主要不飽和脂肪酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)87.8%，其中富含油酸及亞油酸，GB 11765—2003描述油茶籽的主要脂肪酸組成為飽和酸7%～11%、油酸74%～87%、亞油酸7%～14%，本研究所測得的各項(xiàng)脂肪酸指標(biāo)均在標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)。水酶法制得的油茶籽油中微量物質(zhì)角鯊烯含量為 114.4 mg/kg，VE 含量高達(dá)204.5 mg/kg，高于文獻(xiàn)［3］所述橄欖油的VE含量168 mg/kg。這說明環(huán)境友好型的低溫制油工藝——水酶法對生物活性成分具有保護(hù)優(yōu)勢。

3 結(jié)論

3.1 水酶法提取油茶籽油的最佳工藝條件為:酶用量 2.62%(蛋白酶∶纖維素酶 =4∶1)，酶解溫度 52.1℃，料液比1∶5.58，酶解 pH 6.47，超聲時間 20 min，加熱預(yù)處理90℃、20 min，酶解時間5 h。在此條件下，出油效率高達(dá)83%，蛋白水解率為90.4%。

3.2 水酶法提取的油茶籽毛油的苯并(α)芘含量完全在安全范圍內(nèi)。

3.3 水酶法提取油茶籽毛油色澤清亮，無異味，酸價(jià)、過氧化值等理化指標(biāo)均合格，污染少，無須精煉加工，節(jié)約了油脂加工的成本。此外，水酶法加工過程對不飽和脂肪酸、VE、角鯊烯等生物活性成分保留較好，是一種“安全、高效、綠色”的制油工藝。

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