亞健康狀態(tài)大鼠的神經(jīng)－免疫－內(nèi)分泌機(jī)制的研究

徐孝平，潘永明，劉瑞敏，壽旗揚(yáng)，賈臨超，周衛(wèi)民，朱科燕，陳民利

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)研究中心/比較醫(yī)學(xué)研究中心，杭州 310053)

亞健康狀態(tài)大鼠的神經(jīng)－免疫－內(nèi)分泌機(jī)制的研究

徐孝平，潘永明，劉瑞敏，壽旗揚(yáng)，賈臨超，周衛(wèi)民，朱科燕，陳民利

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)研究中心/比較醫(yī)學(xué)研究中心，杭州 310053)

目的 探討亞健康狀態(tài)大鼠的神經(jīng)－免疫－內(nèi)分泌的機(jī)制。方法 取雄性SPF級Wistar大鼠36只，按體重隨機(jī)分成6組，即多因素組(MF)、多因素干預(yù)組(MFT)、熱水游泳組(WS)、睡眠不足組(SD)、單純束縛組(PC)和正常對照組(C)，每組6只。分別采用熱水游泳、飲食限制、睡眠剝奪、束縛等方式建立亞健康大鼠模型，多因素干預(yù)組每日經(jīng)口給予300 mg/kg的抗衰老片，在造模5 d后處理動物，并取大鼠血，分別測定血清5－羥色胺(5－HT)、多巴胺(DA)、甲狀腺激素 T3和 T4、睪酮(T)、皮質(zhì)酮(CORT)、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、白介素 IL－1β、IL－2、IL－6、IL－8和IFN－γ含量以及T淋巴細(xì)胞亞群的變化，并取脾臟測定 T、B淋巴細(xì)胞增殖能力和 NK細(xì)胞活性變化。結(jié)果(1)與正常對照組比，①造模結(jié)束后多因素組大鼠血清5－HT明顯降低(P＜0.05)，而熱水游泳組和單純束縛組5－HT含量卻升高顯著(P＜0.01)，且睡眠不足組和單純束縛組血清DA含量降低顯著(P＜0.05);同時各亞健康模型大鼠的血清T3、T4、CORT和ACTH含量均顯著升高(P＜0.01)，T/C比值降低顯著(P＜0.01)，且睡眠不足組血清T降低明顯(P＜0.05);②造模結(jié)束后多因素組的大鼠IL－8含量降低顯著(P＜0.01)，而熱水游泳組和單純束縛組 IL－1β、IL－2、IL－6、IL－8 和 IFN－γ 含量以及睡眠不足組 IL－1β、IL－2、IL－6 含量均顯著升高(P ＜ 0.05，P ＜0.01)，同時顯著降低各亞健康模型大鼠淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化能力和 T淋巴細(xì)胞亞群CD3+、CD4+和CD4+/CD8+比值和NK細(xì)胞活性(P＜0.05，P＜0.01)。(2)與多因素組比，抗衰老片干預(yù)后多因素干預(yù)組大鼠血清 DA含量明顯升高(P＜0.05)，并能顯著提高機(jī)體 T淋巴細(xì)胞亞群 CD3+、CD4+數(shù)目和 CD4+/CD8+比值(P＜0.01)，降低血清CORT含量。結(jié)論 亞健康狀態(tài)能引起大鼠HPA軸反應(yīng)性失衡，皮質(zhì)醇釋放過度，引起內(nèi)分泌的紊亂，并能引起淋巴細(xì)胞功能降低，出現(xiàn)明顯機(jī)體免疫抑制現(xiàn)象;而抗衰老片具有抗應(yīng)激，提高T細(xì)胞免疫功能，改善情緒和內(nèi)分泌紊亂的作用，從而達(dá)到改善亞健康體質(zhì)的目的。

神經(jīng)遞質(zhì);免疫;內(nèi)分泌;亞健康;淋巴細(xì)胞亞群;抗衰老片

隨著社會科技不斷發(fā)展，人們的生活節(jié)奏的日益加快和社會競爭日趨激烈，人們遭受的情緒應(yīng)激逐漸增多，嚴(yán)重影響了人們的生活質(zhì)量和工作效率。世界衛(wèi)生組織(WHO)提出，亞健康狀態(tài)是健康與疾病之間的臨界狀態(tài)［1］，全球調(diào)查結(jié)果顯示，全世界真正健康的僅占5%，確診有疾病的占20%，而75%則處于亞健康狀態(tài)。在美國醫(yī)學(xué)界已將亞健康與艾滋病一起列為21世紀(jì)人類健康的最大敵人［2］。

目前認(rèn)為亞健康狀態(tài)是由于心理、生理、社會三方面因素導(dǎo)致機(jī)體的神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)整體協(xié)調(diào)失衡、功能紊亂而致，而亞健康發(fā)生發(fā)展的主要因素包括不良的生活方式和習(xí)慣、精神過度緊張和不良的心理因素刺激、環(huán)境污染的不良影響以及機(jī)體的生物學(xué)因素(個性特征和遺傳因素)有關(guān)［3］。我們前期已根據(jù)亞健康形成的主要原因，采用單純束縛、熱水游泳、部分睡眠剝奪和飲食不節(jié)等造模因素復(fù)制亞健康狀態(tài)大鼠模型，研究發(fā)現(xiàn)亞健康狀態(tài)大鼠出現(xiàn)明顯的心理因素的改變和疲勞等癥狀，胸腺系數(shù)的明顯降低則表明亞健康狀態(tài)具有免疫抑制的現(xiàn)象，且氧化應(yīng)激亦參與亞健康的形成過程?？梢姡瑱C(jī)體的神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)整體協(xié)調(diào)失衡、功能紊亂可能是亞健康形成的主要機(jī)制。為證實(shí)亞健康狀態(tài)神經(jīng)－免疫－內(nèi)分泌的作用機(jī)制，本研究對亞健康狀態(tài)大鼠的神經(jīng)遞質(zhì)、內(nèi)分泌激素和免疫指標(biāo)進(jìn)行了觀察，探討亞健康狀態(tài)大鼠的神經(jīng)－免疫－內(nèi)分泌軸變化情況，為亞健康狀態(tài)的生理病理機(jī)制的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

健康雄性SPF級Wistar大鼠，體質(zhì)量為150 g～170 g，36只，購于中科院上海實(shí)驗(yàn)動物中心/上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物公司［SCXK(滬)2007－0005］，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)研究中心屏障系統(tǒng)內(nèi)［SYXK(浙)2008－0115］，環(huán)境溫度為(23 ±1)℃，相對濕度為50%～65%，飼喂全價營養(yǎng)顆粒飼料，自由飲水。

1.2 主要儀器與試劑

BIO－Rad 酶標(biāo)儀(美國 BIO－Rad 公司)，蔡司ZEISS熒光倒置顯微鏡(蔡司公司)，Thermo CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo公司);Epics Altra流式細(xì)胞儀(美國貝克曼庫爾特公司);5－羥色胺(5－HT)、多巴胺(DA)、甲狀腺激素 T3、T4、睪酮(T)、皮質(zhì)酮(CORT)、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、白介素 IL－1β、IL－2、IL－6、IL－8 和 IFN－γ 試劑盒由 Bio－rad 公司提供，RPMI－1640培養(yǎng)基購自 Gibco，胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，四甲基偶氮哩藍(lán)(MTT)、刀豆蛋白 A(ConA)均為進(jìn)口分裝，PMS購自SIGMA，淋巴細(xì)胞分離液購自上海恒信化學(xué)試劑有限公司，NAD、INT 均購自 Amresco，YAC－1 細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所?？顾ダ掀烧笄啻簩毸帢I(yè)有限公司提供(批號:080320)。CD3+，CD4+，CD8+試劑盒:CD3+:FITC標(biāo)記，CD4+:PE標(biāo)記，CD8+:PE標(biāo)記，均由美國eBioscience公司生產(chǎn);紅細(xì)胞裂解液，杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

1.3 動物分組及處理方法

所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一段時間后，按體重隨機(jī)分成6組，即多因素(熱水游泳、睡眠剝奪、飲食限制等因素)組、多因素藥物干預(yù)組、熱水游泳組、睡眠不足組、單純束縛組和正常對照組，每組6只。各組分別作以下造模處理:(1)多因素組(multifactor group，MF):大鼠每天上午 8∶00在水溫 43℃ ±0.5℃的水槽中游泳3 min，之后迅速撈起并擦干身體，放回飼養(yǎng)籠，在上午9∶00～19∶00將大鼠放置睡眠剝奪裝置中剝奪睡眠10 h，隨后放回飼養(yǎng)籠中，并在晚上19∶00加入足量的普通飼料，暴食1 h，20∶00取出剩余飼料，連續(xù) 5 d;(2)多因素干預(yù)組(multifactor treatment group，MFT):造型方法與多因素組相同，并于每天上午7∶50給予300 mg/kg抗衰老片浸膏粉，連續(xù)5 d;(3)熱水游泳組(warm swimming group，WS):每天上午8∶00在水溫(43±0.5)℃的水槽中游泳3 min，之后迅速撈起并擦干身體，放回飼養(yǎng)籠;上午8∶30，下午15∶30加足飼料并更換飲水瓶，連續(xù)5 d;(4)睡眠不足組 (sleep deficiency group，SD):每天 9∶00～19∶00 睡眠剝奪10 h;上午8∶30，下午15∶30加足飼料并更換飲水瓶，連續(xù) 5 d;(5)單純束縛組(purely constraint group，PC):每天下午 14∶00～17∶00放于自制束縛桶里限制大鼠活動3 h，連續(xù)5 d;(6)正常對照組(control group，C)即不處理:每天上午 8∶30，下午15∶30加足飼料并更換飲水瓶，正常飼養(yǎng)。所有動物造模處理5 d后麻醉處死。亞健康大鼠模型的確定:經(jīng)血生化、組織病理等檢查，均未發(fā)現(xiàn)亞健康狀態(tài)大鼠出現(xiàn)明顯的病理變化，但大鼠已表現(xiàn)出精神萎靡、疲勞、反應(yīng)遲鈍、活力減退等。

1.4 指標(biāo)觀察

1.4.1 大鼠神經(jīng)遞質(zhì)、內(nèi)分泌和免疫指標(biāo)的測定:大鼠麻醉后，腹主靜脈取血，離心，分離血清，采用ELISA 法 測 定 血 清 5－HT、DA、T3、T4、T、CORT、ACTH、IL－1β、IL－2、IL－6、IL－8 和 IFN－γ 含量。

1.4.2 T、B淋巴細(xì)胞增殖能力測定:無菌條件下取大鼠的脾臟，加適量 Hank＇s液研磨，以200目不銹鋼網(wǎng)濾過，1 500 r/m離心 5 min，棄上清液，加Hank＇s液重復(fù)洗滌2次。收集脾細(xì)胞，加適量RPMI 1640培養(yǎng)液混懸，以0.4%臺盼蘭拒染法計數(shù)，活細(xì)胞數(shù)不小于95%，加RPMI 1640完全培養(yǎng)液稀釋，并調(diào)整細(xì)胞濃度至1×107個/mL。于96孔微量板中，每孔加100 μL脾細(xì)胞懸液(1×107cell/mL)和等體積的 ConA溶液(終濃度為 5 μg/mL)、LPS溶液(終濃度為10 μg/mL)或 RPMI1640培養(yǎng)液，重復(fù)3孔。另設(shè)空白對照組。37℃、5%CO2培養(yǎng)44 h后，各孔加入50 μL MTT溶液(2 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。1 000 r/min離心5 min，棄去各孔上清液，分別加150 μL酸性DMSO溶液，振蕩，于室溫暗處放置15 min，以酶標(biāo)儀于波長578 nm處測定A值，并按下式計算刺激指數(shù)(SI):SI(刺激指數(shù))=加有絲分裂原培養(yǎng)物的A值/不加有絲分裂原培養(yǎng)物的A值。

1.4.3 NK細(xì)胞活性測定:實(shí)驗(yàn)前24 h將靶細(xì)胞YAC－1傳代培養(yǎng)，應(yīng)用前以 Hank＇s液洗 3 次，用RPMI 1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105個/mL。無菌取脾，制備脾細(xì)胞懸液，用 Hank＇s液洗2次，每次離心10 min(1 000 r/min)。棄上清液將細(xì)胞漿彈起，加入0.5mL滅菌水裂解紅細(xì)胞，20 s后再加入0.5mL 2倍Hanks液及8mL Hanks液，離心10 min(1 000 r/min)，用 1mL含10%小牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)液重懸，用1%冰醋酸稀釋后計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107個/mL。將靶細(xì)胞加入 96 孔培養(yǎng)板，每孔 100 μL，試驗(yàn)孔加入 100 μL脾細(xì)胞(效靶比50∶1)，自然釋放孔加入100 μL培養(yǎng)液，最大釋放孔加入 100 μL 2%NP40，37℃培養(yǎng)4 h，離心，取上清液100 μL置96孔酶標(biāo)板中，加入LDH 基質(zhì)液 100 μL，反應(yīng) 8 min，以 30 μL 1mol/L 的HCl終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀492 nm處測定A值。

NK細(xì)胞活性(%)=(反應(yīng)孔A－自然釋放孔A)/(最大釋放孔A－自然釋放孔A)×100%

1.4.4 T淋巴細(xì)胞亞群測定:取血加抗體，大鼠眼眶取血1mL，用EDTAk3血常規(guī)管抗凝全血，試管標(biāo)號;取50 μL抗凝全血，分別加入試管①、試管②，直接加至底部，且不可觸壁;試管①統(tǒng)一加5 μL抗體CD3+和 5 μL 抗體 CD4+，試管②統(tǒng)一加 5 μL 抗體CD3+和5 μL抗體 CD8+，用振蕩器混勻后暗室放置20～30 min，使抗體與血樣充分結(jié)合;避光常溫30 min后，加裂解液:試管在振蕩中加入500 μL裂解液，在30℃水浴中放置15 min，使細(xì)胞充分裂解，達(dá)到透亮;裂解后，1 500 r/min離心5 min，倒去上清液，用PBS液洗兩遍，加1mL PBS液，1 500 r/min離心5 min，后倒去上清液;再加1mL PBS液，1 500 r/min離心5 min;離心后倒去上液;加500 μL PBS液，再用Epics Altra流式細(xì)胞儀檢測。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 亞健康模型大鼠血清5-HT和多巴胺含量的變化

與正常對照組比，造模5 d后多因素組的大鼠血清5－HT和 DA含量均出現(xiàn)降低，其中血清5－HT降低顯著(P＜0.05)，而熱水游泳組、睡眠不足組和單純束縛組的大鼠血清5－HT含量均出現(xiàn)升高和DA含量的降低，且以熱水游泳組和單純束縛組升高5－HT含量顯著(P＜0.01)，同時，睡眠不足組和單純束縛組的大鼠血清DA含量均顯著降低(P＜0.05);與多因素組比，抗衰老片干預(yù)后多因素干預(yù)組大鼠具有升高5－HT含量和DA含量的作用，其中DA升高顯著(P＜0.05)，見表1。

另外，與正常對照組比，造模5d后多因素組、熱水游泳組、睡眠不足組、單純束縛組大鼠的血清T3、T4均明顯升高(P＜0.01);與多因素組比，抗衰老片干預(yù)后多因素干預(yù)組的大鼠T3、T4含量均有降低趨勢，但差異不顯著(P＞0.05)，見表1。

2.2 亞健康模型大鼠血清睪酮(T)、皮質(zhì)酮(CORT)和促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)含量的變化

與正常對照組比，造模5 d后，各亞健康模型大鼠的睪酮T含量出現(xiàn)降低，其中睡眠不足組降低顯著(P＜0.05)，同時各亞健康模型大鼠伴有皮質(zhì)酮CORT和促腎上腺皮質(zhì)激素ACTH含量的顯著升高(P＜0.01)，且引起T/C比值降低顯著(P＜0.01);與多因素組比，抗衰老片干預(yù)后多因素干預(yù)組能升高T、T/C和降低CORT含量的趨勢(P＞0.05)，見表2。

2.3 亞健康模型大鼠血清 IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8和IFN-γ含量的變化

與正常對照組比，造模5d后多因素組的大鼠IL－1β、IL－2、IL－6 有上升趨勢，但 IL－8 和 IFN－γ 含量均有所降低，其中IL－8含量降低顯著(P＜0.01)，而熱水游泳組和單純束縛組的大鼠 IL－1β、IL－2、IL－6、IL－8 和 IFN－γ 含 量均顯著升高(P ＜0.05，P ＜0.01)，睡眠不足組的大鼠 IL－1β、IL－2、IL－6 含量均顯著升高(P ＜0.05，P ＜0.01)，而 IL－8 和 IFN－γ 含量雖有升高，但差異不顯著(P＞0.05);抗衰老片干預(yù)后多因素干預(yù)組與多因素組和正常對照組比差異均不顯著(P＞0.05)，見表3。

表1 各組亞健康模型大鼠血清5－羥色胺(5－HT)、多巴胺(DA)、甲狀腺激素 T3、T4含量的變化(x±s，n=6)Tab.1 The changes of 5－HT，DA，T3and T4contents in the sub－h(huán)ealth rats(x±s，n=6)

表2 各組亞健康模型大鼠血清T、CORT、T/C和ACTH含量的變化(±s，n=6)Tab.2 The changes of T，CORT，T/C and ACTH contents in the sub－h(huán)ealth rats

注:與正常對照組比，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;多因素組與多因素干預(yù)組比，#P ＜0.05，##P ＜0.01.Note:Compared with the control group，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;Compared between the MF and MFT groups，#P ＜0.05，##P ＜0.01.

組別Groups 睪酮(T)(ng/mL)皮質(zhì)酮(CORT)(ng/mL)睪酮/皮質(zhì)酮T/C 促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)(pg/mL)多因素組(MF)10.48±2.66 273.05±53.37＊＊ 0.04±0.02＊＊ 198.14±25.17＊＊09多因素干預(yù)組(MFT)11.98±5.49 243.34±44.67＊＊ 0.05±0.02＊＊ 205.08±51.38＊＊熱水游泳組(WS)8.51±1.62 168.38±17.72＊＊ 0.05±0.02＊＊ 174.82±65.28＊＊睡眠不足組(SD)6.90±1.18* 225.15±77.78＊＊ 0.03±0.01＊＊ 167.63±30.15＊＊單純束縛組(PC)9.35±2.50 301.29±80.05＊＊ 0.03±0.01＊＊ 206.22±94.00＊＊正常對照組(C)13.18±4.24 31.91±13.81 0.42±0.27 56.68±28.

表3 各組亞健康模型大鼠血清 IL－1β、IL－2、IL－6、IL－8 和 IFN－γ 含量的變化(±s，n=6)Tab.3 The changes of IL－1β，IL－2，IL－6，IL－8 and IFN－γ contents in the sub－h(huán)ealth rats

注:與正常對照組比，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;多因素組與多因素干預(yù)組比，#P ＜0.05，##P ＜0.01.Note:Compared with the control group，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;Compared between the MF and MFT groups，#P ＜0.05，##P ＜0.01.

組別 Groups IL－1β(pg/ml)IL－2(pg/ml)IL－6(pg/ml)IL－8(pg/ml)IFN－γ(pg/ml)多因素組(MF)183.03±6.76 336.79±16.72 329.96±36.19 601.14±58.37＊＊.97±94.87 605.09±92.44 528.46±57.12多因素干預(yù)組(MFT)200.17±26.80 341.36±44.17 300.45±47.67 685.49±128.02 575.58±89.98熱水游泳組(WS)220.80±22.54＊＊ 390.48±31.74＊＊ 390.06±43.40＊＊ 884.55±34.97* 722.29±65.04*睡眠不足組(SD)210.47±17.11＊＊ 386.30±40.98* 379.35±36.16＊＊ 836.94±75.75 636.27±66.62單純束縛組(PC)218.42±18.64＊＊ 434.01±50.35＊＊ 439.05±26.25＊＊ 940.79±68.82＊＊ 751.44±100.10*正常對照組(C)173.24±10.90 320.27±34.45 289.74±32.64 759

2.4 亞健康模型大鼠NK細(xì)胞、淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化能力的變化

與正常對照組比，造模5 d后各亞健康模型大鼠NK細(xì)胞均有所下降，其中多因素組、多因素干預(yù)組、睡眠不足組、單純束縛組降低顯著(P＜0.05，P＜0.01);而各亞健康模型大鼠淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化能力均顯著降低(P＜0.05，P＜0.01);與多因素組比，抗衰老片干預(yù)后多因素干預(yù)組的大鼠NK細(xì)胞、淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化能力均有所上升，但差異不顯著(P ＞0.05)，見表4。

表4 各組亞健康模型大鼠NK細(xì)胞、淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化能力的影響(± s，n=6)Tab.4 The changes of NK cells and lymphocyte proliferation ability in the sub－h(huán)ealth rats

表4 各組亞健康模型大鼠NK細(xì)胞、淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化能力的影響(± s，n=6)Tab.4 The changes of NK cells and lymphocyte proliferation ability in the sub－h(huán)ealth rats

注:與正常對照組比，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;多因素組與多因素干預(yù)組比，#P＜0.05，##P＜0.01.Note:Compared with the control group，*P ＜ 0.05，＊＊P ＜ 0.01;Compared between the MF and MFT groups，#P ＜0.05，##P ＜0.01.

Groups NK% ConA LPS多因素組(MF)41.08±6.07＊＊ 1.72±0.22＊＊ 1.05±0.03組別＊＊62.20±11.16 2.42±0.46 1.19±0.11多因素干預(yù)組(MFT)42.61±16.58* 1.81±0.12＊＊ 1.06±0.02＊＊熱水游泳組(WS)46.83±9.98 1.62±0.10＊＊ 1.06±0.04＊＊睡眠不足組(SD)36.61 ±5.43＊＊ 1.79 ±0.21＊＊ 1.06 ±0.06＊＊單純束縛組(PC)32.26±6.69＊＊ 1.99±0.32* 1.08±0.04*正常對照組(C)

2.5 各亞健康模型大鼠T淋巴細(xì)胞亞群的變化

與正常對照組比，造模5 d后各亞健康模型大鼠T淋巴細(xì)胞亞群 CD3+、CD4+和 CD4+/CD8+比值顯著降低(P＜0.01)，而CD8+與正常對照組差異無顯著性(P＞0.05);與多因素組比，抗衰老片干預(yù)后多因素干預(yù)組的 CD3+、CD4+和 CD4+/CD8+比值顯著升高(P＜0.01)，見表5。

表5 各組亞健康模型大鼠T淋巴細(xì)胞亞群的變化(± s，n=6)Tab.5 Changes of T lymphocyte subpopulations in the sub－h(huán)ealth rats

表5 各組亞健康模型大鼠T淋巴細(xì)胞亞群的變化(± s，n=6)Tab.5 Changes of T lymphocyte subpopulations in the sub－h(huán)ealth rats

注:與正常對照組比，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;多因素組與多因素干預(yù)組比，#P ＜0.05，##P ＜0.01.Note:Compared to control group，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;Compared between the MF and MFT groups，#P ＜0.05，##P ＜0.01.

組別Groups CD3+(%)CD4+(%)CD8+(%)CD4+/CD8+多因素組(MF)51.65±5.91＊＊ 31.88±4.12＊＊ 19.67±1.87 1.62±0.14＊＊73.37±1.19 51.48±1.20 19.42±1.62 2.67±0.23多因素干預(yù)組(MFT)74.98±4.78## 52.20±4.66## 20.90±1.52 2.50±0.19##熱水游泳組(WS)64.90±2.60＊＊ 43.60±1.57＊＊ 19.67±1.64 2.23±0.15＊＊睡眠不足組(SD)63.10±2.58＊＊ 42.27±2.70＊＊ 19.10±0.60 2.21±0.14＊＊單純束縛組(PC)65.22±4.07＊＊ 43.32±2.70＊＊ 20.13±1.46 2.15±0.07＊＊正常對照組(C)

3 討論

亞健康態(tài)是介于健康與疾病兩個狀態(tài)之間，是穩(wěn)態(tài)的相對失衡的狀態(tài)，此時，神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫系統(tǒng)呈現(xiàn)一定紊亂，自主調(diào)節(jié)能力降低，人體出現(xiàn)疾病癥狀，但物理生化檢查往往難以發(fā)現(xiàn)明顯體征異常。已有研究發(fā)現(xiàn)，5－HT是中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)的重要神經(jīng)遞質(zhì)，且在調(diào)節(jié)機(jī)體的情緒方面具有相當(dāng)重要的作用，但5－HT對HPA軸的調(diào)節(jié)作用，目前尚存在爭議。已有研究表明5－HT的增加對失眠、精神狀態(tài)、感知能力和肌肉疲勞程度等都可能產(chǎn)生影響，5－HT活性增強(qiáng)可能與慢性疲勞綜合征有關(guān)［4］;相反，亦有研究認(rèn)為抑郁狀態(tài)、抑郁癥時人體內(nèi) 5－HT 含量顯著降低［5］，詹向紅等［6］的研究發(fā)現(xiàn)憤怒應(yīng)激能使5－HT水平降低。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，熱水游泳組、睡眠不足組和單純束縛組的大鼠血清5－HT含量明顯升高，而多因素組的大鼠血清5－HT含量則顯著降低，均可表明各亞健康狀態(tài)大鼠的情緒出現(xiàn)明顯的變化，且5－HT含量變化趨勢的不同可能與應(yīng)激程度和因素有關(guān)。另外，本研究結(jié)果亦顯示，各亞健康狀態(tài)大鼠的血清DA含量均明顯降低，DA作為一種中樞神經(jīng)遞質(zhì)，也參與調(diào)控精神活動，研究表明，在反復(fù)長期心理應(yīng)激情況下，能使大量的DA被耗竭，最終導(dǎo)致 DA含量的降低［5］，而DA活性的降低，可使肌肉活動的協(xié)調(diào)能力降低，導(dǎo)致疲勞加劇，可見，各亞健康狀態(tài)的大鼠出現(xiàn)明顯的情緒波動和疲勞狀態(tài)，提示亞健康狀態(tài)能引起單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的異常，可能是亞健康狀態(tài)的生理病理機(jī)制之一。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，下丘腦－垂體－腎上腺皮質(zhì)(HPA)軸能調(diào)控促腎上腺皮質(zhì)激素、腎上腺糖皮質(zhì)激素(GC)的分泌，進(jìn)而影響與應(yīng)激有關(guān)的行為、神經(jīng)內(nèi)分泌免疫活動，慢性心理應(yīng)激可使血液中皮質(zhì)酮持續(xù)升高，引起血液中糖皮質(zhì)激素積累，造成內(nèi)分泌代謝過分增加［7］。甲狀腺激素 T3、T4是反映甲狀腺功能的重要指標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各亞健康狀態(tài)的大鼠血清甲狀腺激素 T3、T4以及皮質(zhì)酮(CORT)和促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)含量升高，睪酮(T)含量降低，引起T/CORT比值的降低，提示亞健康狀態(tài)能引起下丘腦－垂體－甲狀腺軸、下丘腦－垂體－腎上腺皮質(zhì)軸和下丘腦－垂體－性腺軸功能紊亂，使甲狀腺激素、皮質(zhì)酮與睪酮分泌異常，導(dǎo)致內(nèi)分泌代謝出現(xiàn)紊亂。但CORT的分泌又可以反饋抑制ACTH和促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)的生成，形成了HPA軸的環(huán)行調(diào)節(jié)通路，但在應(yīng)激的作用下，上述負(fù)反饋抑制效應(yīng)減弱，從而出現(xiàn)ACTH和CORT的分泌增加，導(dǎo)致 HPA軸功能的亢進(jìn)［8］，從而使亞健康大鼠產(chǎn)生緊張、焦慮、憤怒或抑郁的情緒變化和行為改變，以及免疫力和記憶能力的下降等。

心理神經(jīng)免疫學(xué)的研究表明，心理應(yīng)激因素可通過影響中樞神經(jīng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)來改變機(jī)體的免疫能力。結(jié)果顯示，熱水游泳組、睡眠不足組和單純束縛組的大鼠血清 IL－1β、IL－2、IL－6、IL－8 和 IFN－γ活性均顯著升高，而多因素組的大鼠血清 IL－1β、IL－2、IL－6 活性有上升趨勢，但 IL－8 和 IFN－γ 活性均有所下降，從以上結(jié)果顯示各亞健康狀態(tài)大鼠 IL－1β、IL－2、IL－6 活性的升高，可能是由于亞健康狀態(tài)形成過程中體內(nèi)發(fā)熱和骨骼肌的損傷，使得 IL－1β升高，參與刺激肌肉蛋白質(zhì)的分解代謝。也有研究表明，IL－1β和 IL－6除了參與調(diào)節(jié)免疫功能外，對機(jī)體的代謝功能亦有密切的聯(lián)系［9，10］。IL－1β 作用于HPA軸引起 CORT分泌增加，促進(jìn)血糖升高的作用［11］，這與我們前面所研究的各亞健康大鼠血糖升高較為一致，表明亞健康狀態(tài)大鼠的血清 IL－1β濃度增加主要是促進(jìn) CORT分泌以升高血糖，Albert Moraska［12］認(rèn)為機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)時，IL－1β 濃度的增加對免疫功能也有抑制作用。IL－2主要由淋巴細(xì)胞亞群 TCD4+和 TCD8+產(chǎn)生，NK細(xì)胞和 LAK細(xì)胞也可產(chǎn)生，IL－1β 亦能促進(jìn) T 細(xì)胞產(chǎn)生 IL－2［7］，而亞健康狀態(tài)大鼠血清 IL－1β活性升高促進(jìn) IL－2升高;另外，由于HPA軸調(diào)節(jié)激活 T細(xì)胞分泌 IL－2，且在亞健康形成過程中皮質(zhì)酮大量的釋放亦會導(dǎo)致IL－2升高。IL－6是一種致炎因子，由Th2細(xì)胞分泌，參與介導(dǎo)體液免疫功能，在炎癥和感染時生成和釋放增加。Nukina等［13］研究表明束縛應(yīng)激可通過中樞和外周兒茶酚胺升高血漿IL－6的活性水平，亦有報道認(rèn)為運(yùn)動時的血漿細(xì)胞因子，尤其是IL－6主要來源于收縮的骨骼肌細(xì)胞，而不是免疫細(xì)胞，并認(rèn)為運(yùn)動過程中肌肉產(chǎn)生的 IL－6 有免疫抑制作用［9］，IL－6可通過促進(jìn)腎上腺皮質(zhì)分泌 CORT，使血糖升高。IL－8是一種由單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等產(chǎn)生的中性粒細(xì)胞激活蛋白，具有趨化和激活多形核白細(xì)胞作用，可升高細(xì)胞內(nèi) Ca2+的濃度等，研究發(fā)現(xiàn)IL－8在多器官功能障礙至衰竭的發(fā)展過程具有重要作用，并在創(chuàng)傷性疾病中機(jī)體IL－8活性明顯升高［14］，但張銀娥等［7］研究認(rèn)為慢性心理應(yīng)激大鼠血清IL－8活性明顯降低，本研究結(jié)果顯示，熱水游泳組、睡眠不足組和單純束縛組的大鼠血清IL－8活性明顯升高，而采用多因素造模的大鼠血清IL－8活性明顯降低，可能與應(yīng)激的程度和時間的不同，導(dǎo)致HPA軸反應(yīng)性和皮質(zhì)酮釋放程度的差異所致，但I(xiàn)L－8活性的變化可表明亞健康狀態(tài)形成過程炎癥反應(yīng)參與其中。IFN－γ主要由 Th1細(xì)胞分泌，介導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)，能誘導(dǎo)單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等MHCⅡ類抗原的表達(dá)，使其參與抗原提呈和特異性免疫的識別過程。因此，IFN－γ在細(xì)胞免疫中具有重要激活作用，有研究表明心理應(yīng)激可引起循環(huán)血中 IFN－γ的升高［15］，本研究結(jié)果顯示，熱水游泳組、睡眠不足組和單純束縛組的大鼠血清 IFN－γ活性均有所升高，證實(shí)各亞健康狀態(tài)大鼠出現(xiàn)明顯的心理應(yīng)激變化，而盧莉等［16］研究認(rèn)為慢性應(yīng)激組小鼠血清中IFN－γ水平明顯下降，表明慢性應(yīng)激可抑制Th1類細(xì)胞因子，使Th1/Th2的平衡向Th2偏移，從而引起機(jī)體的細(xì)胞免疫功能下降，導(dǎo)致機(jī)體的防御能力下降，而本研究的多因素組的大鼠血清IFN－γ活性亦出現(xiàn)下降趨勢，提示可能由于應(yīng)激程度和時間的不同，導(dǎo)致其介導(dǎo)的HPA軸和交感神經(jīng)系統(tǒng)(SNS)通路在不同的造模過程中起決定性因素有所不同。

另外，本研究采用脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和 NK細(xì)胞釋放實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步評估各亞健康狀態(tài)大鼠的免疫狀態(tài)，結(jié)果顯示，亞健康狀態(tài)的大鼠可抑制ConA、LPS誘導(dǎo)的脾細(xì)胞增殖反應(yīng);其中ConA誘導(dǎo)的脾細(xì)胞增殖反應(yīng)可反映T細(xì)胞功能，LPS誘導(dǎo)的脾細(xì)胞增殖反應(yīng)可反應(yīng)B細(xì)胞的功能，表明亞健康狀態(tài)可引起T、B細(xì)胞功能的減退，提示細(xì)胞免疫和體液免疫功能降低;NK細(xì)胞釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦顯示亞健康狀態(tài)的大鼠NK細(xì)胞活性顯著降低，即出現(xiàn)明顯的機(jī)體細(xì)胞免疫功能的降低。T細(xì)胞是機(jī)體內(nèi)重要的免疫細(xì)胞，根據(jù)表面分子可分為 CD3+、CD4+、CD8+等，因此，機(jī)體內(nèi) CD3+、CD4+、CD8+數(shù)目的變化是機(jī)體免疫功能變化的重要標(biāo)志，有研究表明，心理應(yīng)激會引起機(jī)體 T細(xì)胞亞群的數(shù)目減少［17］。本研究結(jié)果顯示，各亞健康狀態(tài)大鼠 CD3+、CD4+數(shù)目明顯減少，CD8+數(shù)目變化不明顯，CD4+/CD8+比值顯著降低，表明亞健康狀態(tài)大鼠出現(xiàn)了明顯的免疫抑制，這與羅威和傅京麗等［18，19］報道臨床慢性疲勞綜合癥患者 CD3+、CD4+數(shù)目明顯減少較為一致。

抗衰老片是目前國內(nèi)有較大知名度的抗衰老中成藥，具有抗氧化應(yīng)激和提高免疫功能的作用［20－23］，本研究對多因素造模的大鼠采用抗衰老片干預(yù)后，結(jié)果顯示，多因素干預(yù)組的大鼠明顯升高血清DA，提高機(jī)體T淋巴細(xì)胞亞群 CD3+、CD4+數(shù)目和CD4+/CD8+比值的作用，降低血清 CORT含量，提示抗衰老片具有抗應(yīng)激，提高T細(xì)胞免疫功能，改善情緒和內(nèi)分泌紊亂的作用。

［1］王廣儀.微量元素與亞健康［J］.微量元素與健康研究，2010，27(4):54－57.

［2］董玉整.“亞健康”初探［J］.廣州醫(yī)學(xué)院報，1988，26(3):77－78.

［3］何寶先.亞健康人群的健康管理及其干預(yù)措施［J］.河南預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2009，20(3):224－225.

［4］陳易新，王天芳，季紹良，等.慢性疲勞病理機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究—慢性束縛致大鼠慢性疲勞動物模型單胺類物質(zhì)的改變及中藥調(diào)節(jié)作用［J］.中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2000，6(4):23－26.

［5］李艷，嚴(yán)燦，史亞飛，等.反復(fù)心理應(yīng)激大鼠血漿和下丘腦單胺神經(jīng)遞質(zhì)的變化及加味四逆散的影響［J］.中藥藥理與臨床，2002，18(1):1－3.

［6］詹向紅，李偉，趙君玫，等.慢性憤怒應(yīng)激對大鼠衰老進(jìn)程及其神經(jīng)內(nèi)分泌免疫機(jī)制的影響［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2010，25(1):111－113.

［7］張銀娥，宋輝，楊惠芳，等.運(yùn)動對慢性心理應(yīng)激大鼠行為及血清皮質(zhì)醇、IL－2、IL－8的影響［J］.中國工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志，2007，20(2):79－85.

［8］Holsboer F.Prospects for antidepressant drug discovery［J］.Biol Psychol，2001，57(1/3):47－65.

［9］何偉.運(yùn)動與細(xì)胞因子的研究進(jìn)展［J］.體育科學(xué)，2005，25(7):63－67.

［10］Febbraio MA.， Pedersen BK.Muscle－derived Interleukin－6:mechanisms for activation and possible biological roles［J］.FASEB J，2002，16:1335－1347.

［11］Suzuki K，Totsuka M，Nakaji S，et al.Endurance exercise causes interaction among stress hormones，cytokines，neutrophil dynamics，and muscle damage［J］.J Appl Physiol，1999，87:1360－1367.

［12］Moraska A，Campisi J，Kien T.et al.Elevated IL－1 contributes to antibody suppression produced by stress［J］.J Appl Physiol，2002，93(6):207－215.

［13］Nukina H，Sudo N，Aiba Y，et al.Restraint stress elevates the plasma interleukin－6 levels in germ－free mice ［J］.J Neuroimmunol，2001，115:46－52.

［14］梁紅萍.清熱解毒法對肢體創(chuàng)傷患者血清細(xì)胞因子 IL－8、IL－1β、TNF－α 的影響［J］. 中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2010，28(8):1751－1752.

［15］Chida Y，Sudo N，Kubo C.Social isolation stress exacerbates autoimmune disease in MRL/lpr mice［J］.J Neruoimmunol.2005，158(1－2):138－144.

［16］盧莉，李敏芳 薛朝霞，等.慢性應(yīng)激對小鼠心理行為及血清IFN－γ、IL－4水平的影響［J］. 中國健康心理學(xué)雜志，2010，18(8):1013－1014.

［17］肖春梅，尹玲.中小負(fù)荷運(yùn)動及慢性情緒應(yīng)激對免疫機(jī)能的影響［J］.北京體育大學(xué)學(xué)報，2007，30(7):919－921.

［18］羅威，肖紅茂，馮小武，等.慢性疲勞綜合征對人體T淋細(xì)胞亞群及健康的影響［J］.現(xiàn)代診斷與治療，2007，18(2):114－115.

［19］傅京麗.慢性疲勞綜合征與心身疾病［J］.遼寧醫(yī)學(xué)雜志，1999，13(2):68－69.

［20］魯 珽，潘永明，冷曉霞，等.抗衰老片對實(shí)驗(yàn)性腎陽虛小鼠免疫功能的影響［J］.甘肅中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2011，28(2):8－11.

［21］陶 濤，潘永明，冷曉霞，等.抗衰老片對衰老大鼠學(xué)習(xí)記憶和自由基代謝的影響［J］.浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2009，33(6):751－753.

［22］謝日青，冷曉霞，陳民利，等.束縛應(yīng)激致亞健康狀態(tài)大鼠氧自由基變化及中藥干預(yù)作用［J］.實(shí)驗(yàn)動物與比較醫(yī)學(xué)，2010，30(2):121－123.

［23］肖 慧，冷曉霞，陳民利，等.束縛應(yīng)激致亞健康狀態(tài)大鼠的行為學(xué)改變及中藥的干預(yù)作用［J］.實(shí)驗(yàn)動物與比較醫(yī)學(xué)，2010，30(2)124－128.

Study on the Mechanism of Neuro-Immuno-Endocrine System of Rats in Sub-Health State

XU Xiao－ping，PAN Yong－ming，LIU Rui－min，SHOU Qi－yang，JIA Lin－chao，ZHOU Wei－min，ZHU Ke－yan，CHEN Min－li
(Zhejiang Chinese Medical University Laboratory Animal Research Center/Comparative Medical Research Center，Hangzhou 310053，China)

Objective To explore the mechanism of neuro－immuno－endocrine system of rats in sub－h(huán)ealth state.Methods Thirty－six male SPF Wistar rats were randomly divided into six groups:multi－factor group(MF)，multifactor treatment group(MFT)，warm water swimming group(WS)，sleep deficiency group(SD)，purely constraint group(PC)and control group(C)，six animals in each group.Respectively，using warm water swimming，dietary restrictions，sleep deprivation and constraint to establish sub－h(huán)ealth rat models，and daily orally administered 300 mg/kg anti－aging tablet in the MFT group.At 5 days after modeling，the levels of serum 5－HT，DA，T3，T4，T，CORT，ACTH，IL－1β，IL－2，IL－6，IL－8，IFN－γ and T lymphocyte subsets were detected，and changes of T and B lymphocyte proliferation and NK cell activity in the spleen were also determined.Results(1)Compared with the control group，① Serum 5－HT in the MF group was significantly reduced(P ＜0.05)，while 5－HT in the WS and PC groups was significantly increased(P ＜0.01)，and the serum DA content in the SD and PC groups was significantly decreased(P ＜0.05).At the same time，the serum T3，T4，CORT and ACTH contents in each sub－h(huán)ealth model rats were significantly increased(P ＜ 0.01)，T/C ratio was significantly decreased(P＜0.01)，and the serum T in the SD group was significantly lowered(P＜0.05);② Sserum IL－8 content in the MF group was significantly reduced(P ＜ 0.01)，while the serum IL－1β，IL－2，IL－6，IL－8 and IFN－γ levels in the WS and PC groups，and IL－1β，IL－2 and IL－6 levels in the SD group were all significantly increased(P ＜0.05，P＜0.01)，and the lymphocyte proliferation and T lymphocyte subsets CD3+，CD4+，CD4+/CD8+ratio and NK cell activity were significantly reduced in all sub－h(huán)ealth model rats(P ＜0.05，P ＜0.01).(2)Compared with the MF group，the administration of anti－aging tablets induced significantly increased serum DA content in the MFT group(P ＜ 0.05)，and significantly improved the T lymphocyte subsets CD3+，CD4+，CD4+/CD8+ratio(P ＜0.01)，and lowered serum CORT content.Conclusions Sub－h(huán)ealth state can lead to imbalances of the rat HPA axis，excessive cortisol release，endocrine disorders，reduced lymphocyte function and immune inhibition，while anti－aging tablets have anti－stress effects，enhancing T cell immune function and ameliorating emotional and endocrine disorders，so as to achieve the purpose of improving the sub－h(huán)ealthy physique.

Neurotransmitter;Immune;Endocrine;Sub－h(huán)ealth;Lymphocyte subsets;Anti－aging tablets;Rats

R33

A

1671－7856(2012)08－0033－07

10.3969.j.issn.1671.7856.2012.008.008

2012－06－05

1.浙江省中醫(yī)“治未病”研究專項(xiàng)(中醫(yī)證候亞健康大鼠模型的建立及其比較學(xué)研究，2007WB022);2.受“浙江省衛(wèi)生高層次創(chuàng)新人才培養(yǎng)工程項(xiàng)目”資助。

徐孝平(1978－)，男，實(shí)驗(yàn)師，研究方向:實(shí)驗(yàn)動物與比較醫(yī)學(xué)。E－mail:xxp0001@126.com。

陳民利(1963－)，女，教授，碩導(dǎo)，研究方向:比較醫(yī)學(xué)。E－mail:minlichen01@yahoo.com.cn。