綠膿桿菌分子分型方法研究進(jìn)展

邢 進(jìn)，岳秉飛，賀爭鳴

(中國食品藥品檢定研究院 實驗動物資源研究所，北京 100050)

綠膿桿菌分子分型方法研究進(jìn)展

邢 進(jìn)，岳秉飛，賀爭鳴

(中國食品藥品檢定研究院 實驗動物資源研究所，北京 100050)

綠膿桿菌是一種常見的人畜共患機(jī)會致病菌，廣泛存在于自然界，是造成實驗動物污染和醫(yī)院內(nèi)感染的重要病原菌之一。分子分型方法是病原菌流行病學(xué)分析的重要手段，對于確定感染來源和途徑，檢測交叉污染和流行菌株方面非常有效。本文主要對綠膿桿菌分子分型方法的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

綠膿桿菌;分子分型方法;動物，實驗

對病原菌的特征分析及準(zhǔn)確分型，了解各種不同來源的菌株是否具有相同的起源，在流行病學(xué)分析中必不可少。細(xì)菌分型包括表型分型和分子分型兩種方法，對查找感染源和感染途徑、鑒別地方性菌株和流行性菌株、預(yù)防交叉感染非常重要。傳統(tǒng)的表型方法只靠表型不足以區(qū)別相同基因型的菌株。分子分型方法經(jīng)過十多年的發(fā)展，已具備很好的穩(wěn)定性和分辨力，成為了解細(xì)菌感染的流行病學(xué)特征必不可少的技術(shù)。

綠膿桿菌，又稱銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)是一種常見的人畜共患機(jī)會致病菌，廣泛存在于自然界。該菌也是醫(yī)院內(nèi)感染的重要病原菌之一［1］，在臨床上是導(dǎo)致囊性纖維化患者(CF)、燒傷患者和其他免疫功能低下患者院內(nèi)感染的主要病原［2，3］。由于其自身的天然耐藥性以及廣譜抗生素的廣泛使用，使得多重耐藥綠膿桿菌感染的情況日益嚴(yán)重［4］。在動物中，綠膿桿菌同樣是作為一種機(jī)會致病菌存在于體內(nèi)，呼吸道和腸道內(nèi)均可分離得到。一般情況下并不引起動物發(fā)病，當(dāng)動物免疫力低下時，才會引起動物發(fā)病，甚至死亡。

建立經(jīng)濟(jì)可靠的分型系統(tǒng)能夠更好的對綠膿桿菌進(jìn)行流行病學(xué)分析，各種分子分型方法在綠膿桿菌的流行病學(xué)研究中均有應(yīng)用［5－8］，彌補(bǔ)了表型研究的不足。本文通過比較綠膿桿菌各種分型方法的特點，希望能夠幫助我們選擇方便、快捷、經(jīng)濟(jì)和可靠的分型方法，對綠膿桿菌進(jìn)行流行病學(xué)分析，設(shè)計更合理的感染控制策略。

1 以PCR為基礎(chǔ)的分型方法

1.1 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性(random amplification of polymorphic DNA，RAPD)指紋圖譜

RAPD技術(shù)是1990年由Williams等人建立的一種分析基因多態(tài)性的分型方法［7］，是在PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種分子生物學(xué)技術(shù)。RAPD-PCR通常使用的是9～10 bp的單一隨機(jī)引物，對目標(biāo)基因組進(jìn)行隨機(jī)擴(kuò)增，隨機(jī)擴(kuò)增出多條非特異性條帶，不同的菌株所得到的條帶是不同的。保持RAPD分析的可靠性和重復(fù)性，適合的退火溫度和模板DNA的質(zhì)量至關(guān)重要。PCR的其他條件，如Mg2+濃度、引物濃度和模板濃度等都需要合理的優(yōu)化才能得到理想的指紋圖譜［8］。在菌株遺傳背景不清楚的情況下，RAPD-PCR僅通過幾微克的模板DNA就可以對該種微生物進(jìn)行分型研究。

臨床上，RAPD-PCR與血清學(xué)、形態(tài)學(xué)等方法結(jié)合，能夠很好的揭示綠膿桿菌的流行病學(xué)特征［9］。但是RAPD的缺點是由于很低的退火溫度，反應(yīng)體系細(xì)微的變化就會導(dǎo)致RAPD-PCR圖譜結(jié)果的變化，重復(fù)性很差，而且缺乏標(biāo)準(zhǔn)化，不同實驗室之間的綠膿桿菌PAPD結(jié)果無法在統(tǒng)一的平臺上進(jìn)行比較。由綠膿桿菌的分型結(jié)果表明，RAPD-PCR的分辨力優(yōu)于RFLP和核糖體分型，但低于REP-PCR［10］。

1.2 擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism，AFLP)

AFLP最先由荷蘭科學(xué)家Zebean和Vos在1992年發(fā)明的檢測DNA多態(tài)性的一種方法［11］，最初用于植物基因組的研究。其基本原理是利用1～3種限制性內(nèi)切酶切割目的基因組DNA，通常使用2種內(nèi)切酶，一種識別高頻位點，一種識別低頻位點，EcoR I和Mse I是最常用的兩種酶。所得的擴(kuò)增片段用聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測。若目的基因組酶切片段內(nèi)的序列發(fā)生改變，或者酶切位點發(fā)生堿基突變等情況，最后的酶切片段會隨之改變，PCR擴(kuò)增片段的電泳圖譜多態(tài)性也會相應(yīng)變化。Pirnay等人用AFLP結(jié)合血清學(xué)、藥敏等方法，對比利時河流內(nèi)的綠膿桿菌多樣性和相似性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)該流域具有獨特的流行株［6］。AFLP能夠很好的用于綠膿桿菌院內(nèi)感染的流行病學(xué)研究，進(jìn)行實時的感染暴發(fā)監(jiān)測，能有效的揭示耐藥菌株的來源、感染途徑和分布特點，有助于感染的控制［12］。AFLP與其他分型方法相比，分型能力和分辨力取決于限制性內(nèi)切酶和識別堿基的合理選擇。Putignani等［13］對ICU病房內(nèi)患者下呼吸道綠膿桿菌分離株的基因型分析中表明AFLP與rep-PCR的分型能力相當(dāng)。Naze對新生兒病房綠膿感染的研究中顯示AFLP的分型能力弱于 MLVA［7］，而在有些情況下優(yōu)于 PFGE［14］。

1.3 重復(fù)序列PCR(repetitive element sequencebased PCR，rep-PCR)

rep-PCR 是1991年由 Versalovic等［15］建立的一種細(xì)菌基因組指紋分析方法，由RAPD-PCR方法發(fā)展而來，通過擴(kuò)增細(xì)菌基因組中高度保守重復(fù)序列，分析基因型間的差異［16］。rep-PCR根據(jù)細(xì)菌基因組中廣泛分布的短重復(fù)序列的不同，又分為基因外重復(fù)回文序列(repetitive extragenic palindromic，REP)PCR、腸桿菌基因間重復(fù)一致序列(enterobacterial repetitive intergenic consensus，ERIC)PCR和 BOX-PCR。2004年朱琴應(yīng)用ERIC-PCR對56株耐亞胺培南綠膿桿菌分離株進(jìn)行了聚類分析，結(jié)果將56株耐藥株分出了33 個型別［17］。Syrmis 等［18］人應(yīng)用ERIC-PCR 和BOX-PCR方法對囊性纖維化患者中分離的綠膿桿菌進(jìn)行了分型研究，并與PFGE方法進(jìn)行了對比，結(jié)果顯示兩種rep-PCR方法的分型能力都非常理想。此外，Olive等人應(yīng)用REP-PCR和ERIC-PCR方法的分型研究表明，其分辨力高于RAPD-PCR和核糖分型方法［19］。國內(nèi)應(yīng)用REP-PCR方法，對燒傷病房和肝移植中的綠膿桿菌分離株進(jìn)行分型研究，為臨床用藥提供了依據(jù)［20－21］。Kidd等用不同方法對囊性纖維化患者(CF)中分離到的綠膿桿菌進(jìn)行的分型研究表明，ERIC-PCR 的分辨力與 MLST、PFGE 相比略低［4］。BOX-PCR方法對綠膿桿菌分型的應(yīng)用較少。總之rep-PCR中的上述三種主要方法對于綠膿桿菌的分型，在分辨率和重復(fù)性，效果相當(dāng)。與其它分型方法相比，優(yōu)于RFLP、核糖體分型，比PFGE方法的分辨力略低，但相對操作簡便，經(jīng)濟(jì)，可實現(xiàn)自動化分型，在綠膿桿菌流行病學(xué)監(jiān)測中發(fā)揮重要作用。rep-PCR的主要缺點是所有的遺傳多態(tài)性在細(xì)菌基因組的特定位置，這必然會導(dǎo)致其在分辨力上的局限性。

1.4 多位點可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析(multiplelocus variable-number tandem-repeat analysis，MLVA)

MLVA方法來源于微衛(wèi)星的基因標(biāo)記技術(shù)，是對基因組中可變數(shù)目重復(fù)序列(variable-number tandem-repeat，VNTR)的分析方法。針對每個重復(fù)序列區(qū)段涉及特異性的PCR引物，每個位點內(nèi)的重復(fù)序列數(shù)目一般通過估計此位點的PCR片段大小來確定。一般細(xì)菌基因組中可用于分型的位點在20個左右，比如腸炎沙門氏菌、炭疽芽孢桿菌、鼠疫耶爾森氏菌等。

綠膿桿菌的 MLVA分型研究中，Onteniente等用綠膿桿菌PAO1株的全基因組序列為參考，建立了7個 VNTR位點的 MLVA方法［22］。Vu-Thien等人隨后建立了15個VNTR位點的MLVA方法，這種位點的組合分型更加有效、簡便和快捷。目前MLVA對綠膿桿菌分型的研究主要就是采用的這個方法，具有很好的多態(tài)性，這 15個位點分別是ms77、ms127、ms142、ms172、ms211、ms212、ms213、ms214、ms215、ms216、ms217、ms222、ms223［23－24］。而Naze等［3］人建立了僅采用其中一個位點的MLVA方法，在PCR產(chǎn)物的電泳處理上，不是采用普通的瓊脂糖凝膠電泳，而是采用聚丙烯酰胺凝膠電泳，這種方法使MLVA的分辨力提高了14%。van Mansfeld等人在Vu-Thien的研究基礎(chǔ)上，建立并優(yōu)化了9個位點的分型方法，與PFGE和MLST兩種方法在分辨力、經(jīng)濟(jì)性和便捷性的綜合比較是最佳的分型方案［25］?？傊琈LVA方法的優(yōu)點是不同綠膿桿菌的VNTR的數(shù)目能夠數(shù)字化，通過互聯(lián)網(wǎng)上的數(shù)據(jù)庫可以進(jìn)行比對，菌株的異同一目了然。MLVA方法的關(guān)鍵是對各VNTR片段的大小進(jìn)行確定，對重復(fù)序列長度太小的VNTR位點(小于15nt)，必須要進(jìn)行DNA測序才能夠得出其重復(fù)序列數(shù)［27］。雖然有自動化的設(shè)備和軟件可以對這些片段大小進(jìn)行分析，但是價格很高。目前，MLVA只適用于已知全基因組序列的細(xì)菌，因此其應(yīng)用受到了限制。

1.5 多位點序列分析(multilocus sequencing typing，MLST)

MLST方法作為一種新的分型技術(shù)，源于多位點酶電泳(multilocus enzyme electrophoresis，MLEE)，最初是由 Maiden MC等人在1998年建立并應(yīng)用于對腦膜炎奈瑟菌的分型［26］。它是使用多個(7個以上)400～500 bp大小的管家基因位點的序列型(ST)來描述每一株細(xì)菌的不同［27］。Curran等人最先使用 7個管家基因(acsA、aroE、guaA、mutL、nuoD、ppsA和trpE)對綠膿桿菌的 ST進(jìn)行分析，證明此方法能夠很好的對綠膿桿菌臨床分離株進(jìn)行分型［28－29］。Johnson等人用 MLST和 PFGE 方法對綠膿桿菌進(jìn)行分型比較，結(jié)果MLST的分辨力略高于 PFGE［30］。

MLST是一種操作簡便的分子分型方法，其過程只是直接對生物樣品中的DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后對所得到的管家基因片段進(jìn)行測序［26］。測序所得到的ST結(jié)果可以在互聯(lián)網(wǎng)上的MLST數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對比［31］。然而MLST的不足也顯而易見，雖然其適合于菌株間的進(jìn)化和相關(guān)性分析，但是對于短期內(nèi)的臨床分離株分型在分辨力上存在不足，特別是與PFGE和MLVA方法的比較中證明了這一點［25］［30］。在幾種主流分型方法中，即便不算儀器設(shè)備和分析工具的成本，MLST所需費用也是最高的［25］，因此對綠膿桿菌臨床應(yīng)用并不是很多。

2 以限制性酶切為基礎(chǔ)的分型方法

2.1 核糖體分型(ribotyping)

Ribotryping是一個基于不同細(xì)菌16S和23S rRNA的高度保守序列建立的分子分型方法［10］，通過限制性核酸內(nèi)切酶對細(xì)菌基因組DNA的進(jìn)行酶切，利用凝膠電泳分離不同長度的片段。再用序列標(biāo)記的DNA探針對酶切片段進(jìn)行雜交，該探針包含編碼高度保守16S rRNA和23S rRNA的DNA片段及間隔序列。由于一個生物的基因組中通常有多個核糖體基因，分別存在于不同長度的酶切片段中，因此核糖體分型可以得到類似指紋的結(jié)果，對細(xì)菌進(jìn)行鑒定和分型。該方法可以通過選擇兩種酶的平行實驗，對一種內(nèi)切酶不能識別的區(qū)域進(jìn)行酶切，增加對菌株的分辨力。研究發(fā)現(xiàn)由于核糖體DNA限制性內(nèi)切位點的變異非常慢，菌株的變異不易被檢測到，以至于核糖體分型圖譜的變化很小，可用于評價分離株之間的同源關(guān)系［32］。核糖體分型可用于對臨床綠膿桿菌耐藥菌株的相關(guān)性研究，不過與PFGE和ERIC-PCR等方法的比較研究顯示出了其分型能力和分辨力上的不足［10］。不過通過與血清分型等其它表型方法結(jié)合使用可以達(dá)到不錯的效果［33］。核糖體分型最大的優(yōu)勢是實現(xiàn)了自動化，RiboPrinter全自動微生物基因指紋鑒定系統(tǒng)使研究人員在一天內(nèi)就可得到細(xì)菌的rDNA指紋雜交圖譜。

2.2 限制性酶切片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)

RFLP源于生物基因組DNA的自然變異，RFLP作為第一代DNA分子遺傳標(biāo)記技術(shù)，極大的推動了人類DNA多態(tài)性的研究，現(xiàn)在已廣泛應(yīng)用于用于基因組遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位以及生物進(jìn)化和分類的研究。通過對分離出的DNA片段轉(zhuǎn)印或者其他方法分離，然后通過標(biāo)記的探針對相應(yīng)的基因進(jìn)行檢測［19］，構(gòu)建分子圖譜。RFLP就能夠檢測出堿基插入、缺失、重排或點突變所引起的差異，從而比較不同菌株間DNA水平的差異。一般常用的限制性內(nèi)切酶有 Hind III，BamH I，EcoR，EcoR V，Xba I等。RFLP對靶序列的濃度和質(zhì)量要求很高，低含量、不純的基因組DNA會嚴(yán)重影響RFLP分析結(jié)果。探針可以提高RFLP的分辨力，綠膿桿菌常用外毒素exoA基因探針用于分子流行病學(xué)分析［33］。由于重復(fù)性和分型能力上的不足單純的RFLP方法已經(jīng)很少應(yīng)用于菌株分型。有比較表明，RFLP遠(yuǎn)不如RAPDPCR和PFGE，所以產(chǎn)生了PCR-RFLP技術(shù)，可以更準(zhǔn)確的檢測綠膿桿菌流行株的基因突變情況［6］。

2.3 脈沖場凝膠電泳(pulsed-fieldgel electrophoresis，PFGE)

PFGE是一種脈沖場凝膠電泳技術(shù)，使用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶對細(xì)菌基因組DNA上的酶切位點進(jìn)行識別切割，產(chǎn)生若干10～800 kb的 DNA大片段，通過這些酶切片段的多態(tài)性分析菌株之間的相似性。1984年，Schwartz和Cantor報道了脈沖場電泳的方法［34］，對至少40種病原菌進(jìn)行了 PFGE分型試驗，其中包括綠膿桿菌，解決了分離大片段DNA 難以分離的難題［27］。

PFGE是目前公認(rèn)的用于綠膿桿菌及其他病原菌分子分型和溯源研究的“金標(biāo)準(zhǔn)”。PFGE所產(chǎn)生的酶切圖譜與 RAPD、MLVA、MLST、核糖體分型和RFLP等大多數(shù)分子分型方法相比是更有效的分型工具。Hector試驗了65種限制性內(nèi)切酶用于對綠膿桿菌的酶切效果，結(jié)果證實SPE I是最佳的選擇。不僅所有的酶切片段大于200 kbp，而且片段數(shù)目在30條左右，數(shù)目適中。到目前為止，綠膿桿菌的PFGE分型方法已經(jīng)非常成熟，從使用的酶、酶切時間、電泳條件等都得到了優(yōu)化，Romling等人的研究使PFGE中DNA降解的情況得以控制，對綠膿桿菌的分型能力達(dá)到了100%［35］。1996年，美國疾病預(yù)防控制中心以PFGE技術(shù)為基礎(chǔ)建立了PulseNet細(xì)菌分子分型網(wǎng)絡(luò)，我國疾病預(yù)防控制中心(CDC)也已加入這個網(wǎng)絡(luò)(PulseNet China)，此網(wǎng)絡(luò)目前提供PFGE標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程的下載，包括沙門氏菌、大腸桿菌、空腸彎曲菌食源性病原菌的標(biāo)準(zhǔn)PFGE方法，用以提高對食源性疾病的快速檢測和溯源能力。實驗人員對于電泳結(jié)果的理解和分析各不相同，對結(jié)果的分析就會出現(xiàn)很大差異，因此 Tenover等人經(jīng)過多年的研究提出了 PFGE的解釋標(biāo)準(zhǔn)［36］。作為經(jīng)典的分子分型方法，PFGE已被廣泛的應(yīng)用于各種細(xì)菌的流行病學(xué)研究中，適用于菌株間基因同源性的分析［30］。不過 PFGE的操作相對復(fù)雜、費時、檢測通量?。?9，37］，是制約其應(yīng)用的不利因素。

3 結(jié)論

綠膿桿菌容易發(fā)生變異，很難用表型方法分辨菌株間的異同，甚至導(dǎo)致錯誤的結(jié)果［10－27］。分子分型方法能夠彌補(bǔ)表型分型的不足，理想的分型方法需要具備以下的特征:①100%的分型能力，即能夠?qū)⑺惺茉嚲耆糠中?②高分辨能力，即將同源關(guān)系遠(yuǎn)的菌株分開，而將同一克隆或遺傳相近的菌株聚類到一起;③良好的重復(fù)性;④操作簡便、節(jié)約時間，并且費用低。由此可見，目前還沒有完美的分型方法，每種分子分型方法包含不同分子生物學(xué)技術(shù)組成(表1)，各有優(yōu)點(表2)。同時，所有的分子分型方法都存在一個很大的局限性，即不能夠?qū)Ξ?dāng)前的流行株進(jìn)行實時分析［38］。

表1 不同分型方法涉及的技術(shù)Tab.1 Techniques used in different molecular typing

表2 不同分型方法之間特點比較Tab.2 Comparison of different typing methods

總之，低成本化、自動化、標(biāo)準(zhǔn)化的分子分型方法是細(xì)菌分型研究的發(fā)展方向。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)有技術(shù)會不斷得到完善，同時又會有新的方法不斷涌現(xiàn)。分型方法是我們在微生物學(xué)、遺傳學(xué)、流行病學(xué)等一系列研究中的工具，選擇適合而合理的方法，有效監(jiān)測微生物種群的分子流行病學(xué)變化，才能達(dá)到研究預(yù)期和最終目的。

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Overview of Molecular Typing Methods for Pseudomonas aeruginosa

XING Jin，YUE Bing-fei，HE Zheng-ming
(National Institutes for Food and Drug Control，Institute of Laboratory Animal Resources，Beijing 100050，China)

Pseudomonas aeruginosa is a common zoonotic opportunistic pathogen，widely distributed in nature，is one of important pathogens causing experimental animal pollution and intra-hospital infection.Molecular typing is an important tool in pathogen epidemiology.It is very effective for determining the source of infection and ways to detect crosscontamination and epidemic strains.In this paper，we summarized the research progress of P.aeruginosa molecular typing methods.

Pseudomonas aeruginosa;molecular typing methods;Laboratory animals

R33

A

1671-7856(2012)08-0062-06

10.3969.j.issn.1671.7856.2012.008.015

2012-05-28

邢進(jìn)(1979－)，男，助理研究員，研究方向:實驗動物微生物檢測。E-mail:xjvet@nifdc.org.cn。

賀爭鳴，男，研究員，E-mail:zhengminghe@163.com。