定眩顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

祁 紅，劉傳統(tǒng)

(湖南省石門縣人民醫(yī)院，湖南 常德 415300)

定眩顆粒由制何首烏、枸杞、當(dāng)歸、白芍等11味中藥組方，具有滋養(yǎng)肝腎功效，對美尼爾氏綜合征等有較好療效。為控制制劑質(zhì)量，確保臨床療效，筆者建立了制何首烏、白芍、枸杞子、當(dāng)歸的薄層色譜鑒別方法，并采用高效液相色譜法對主要藥味當(dāng)歸的主要成分阿魏酸和白芍的主要成分芍藥苷的含量進(jìn)行測定，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

島津LC－10AT型高效液相色譜儀，SPD－10Avp紫外檢測器，CLASS－VP色譜工作站;Meter AE240型電子天平。阿魏酸對照品(批號為110773－200611，供含量測定用)、芍藥苷對照品(批號為110736－200424，供含量測定用)、當(dāng)歸對照藥材(批號為9271－200110，供鑒別用)、何首烏對照藥材(批號為0934－200106，供鑒別用)，枸杞子對照藥材(批號為1072－0301，供鑒別用)，均由中國藥品生物制品檢定所提供;定眩顆粒(本院自制，批號分別為 100802，100815，100901);硅膠 G(青島海洋化工廠);甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別[1]

2.1.1 制何首烏

取本品1 g，加乙醚25 mL，加熱回流1 h，放冷，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取何首烏對照藥材0.2 g，加乙醚25 mL，同法制成對照藥材溶液。按處方要求制成缺制何首烏的陰性樣品，同供試品溶液的制備方法，制成陰性對照品溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各5～10 μL，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，使成條狀，以三氯甲烷－甲醇(7∶3)為展開劑，展至約3.5 cm，取出，晾干，再以三氯甲烷－甲醇(20∶1)為展開劑，展至約7 cm，取出，晾干，置紫外光(365 nm)下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對照品溶液則無，見圖1 A。

2.1.2 白芍

取本品1 g，加乙醇50 mL，超聲提取30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，作為供試品溶液。另取芍藥苷對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。取缺白芍的陰性樣品，同供試品溶液的制備方法，制成陰性對照品溶液。吸取上述3種溶液各5～10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷－甲醇(4∶1)為展開劑展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，在日光下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的主斑點(diǎn)，陰性對照品溶液則無，見圖1 B。

2.1.3 枸杞子

取本品6 g，加水50 mL，回流30 min，放冷，離心，取上清液，用乙酸乙酯振搖提取3次，每次30 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)右宜嵋阴? mL使溶解，作為供試品溶液。另取枸杞子對照藥材1 g，加水10 mL，同法制成對照藥材溶液。取缺枸杞子的陰性樣品，同供試品溶液的制備方法，制成陰性對照品溶液。吸取上述3種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷－乙酸乙酯－甲酸(2∶3∶1)為展開劑展開，取出，晾干，置紫外光(365 nm)下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對照品溶液則無，見圖1 C。

2.1.4 當(dāng)歸

取本品1 g，加乙醚50 mL，超聲30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取當(dāng)歸對照藥材0.2 g，加乙醚10 mL，同法制成對照藥材溶液。取缺當(dāng)歸的陰性樣品，同供試品溶液的制備方法，制成陰性對照品溶液。吸取上述3種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正己烷－乙酸乙酯(17∶3)為展開劑展開，取出，晾干，置紫外光(365 nm)下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對照品溶液則無，見圖1 D。

圖1 薄層色譜圖

2.2 阿魏酸含量測定[2]

2.2.1 色譜條件

色譜柱:大連依利特 Hypersil ODS2柱(150 mm×4.6 mm，5 μm);流動相:乙腈 －0.085 mol/L(17 ∶83);流速:1 mL/min;柱溫:35℃;檢測波長:316 nm;進(jìn)樣量:10 μL。理論塔板數(shù)按阿魏酸計(jì)計(jì)算應(yīng)不低于3 000。

2.2.2 溶液制備

精密稱取阿魏酸對照品12.4 mg，置100 mL量瓶中，加70%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取10 mL，置100 mL量瓶中制成每 1 mL 含 12.4 μg 的溶液，即得對照品溶液。精密稱取樣品 1.002 4 g，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇20mL，密塞，稱定質(zhì)量，加熱回流30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，靜置，取上清液用微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

陰性干擾試驗(yàn):取缺當(dāng)歸的陰性對照品，按供試品溶液制備方法制備，進(jìn)樣，測定。結(jié)果表明，處方中其他藥味無干擾。色譜圖見圖2。

線性關(guān)系考察:分別精密吸取對照品溶液 3，5，10，12，15 μL，按上述色譜條件進(jìn)樣測定，以對照品峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣量(X，μg)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 Y=547 536 3.936 X+5 479 803.335，r=0.999 98(n=5)。結(jié)果表明，阿魏酸進(jìn)樣量在 0.037 ～ 0.186 μg 范圍內(nèi)與峰面積積分值線性關(guān)系良好。

圖2 阿魏酸高效液相色譜圖

精密度試驗(yàn):精密吸取對照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，按上述色譜條件測定。結(jié)果阿魏酸峰面積積分值的平均值為681 630，RSD=0.19%(n=5)，表明方法精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn):取同一批樣品(批號為100802)6份，依法測定。結(jié)果阿魏酸平均含量為 0.236 mg/g，RSD=1.33%(n=6)，表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一供試品溶液，分別在 0，2，4，6，12，24 h時(shí)依法測定。結(jié)果峰面積積分值的 RSD=0.32%(n=6)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn):取已知含量的樣品(批號為100802)2 mL，精密加入一定量阿魏酸對照品，按供試品溶液制備方法制備溶液，依法測定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

表1 阿魏酸加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.2.4 樣品含量測定

分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀測定，以外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果批號為100802，100815，100901的 3 批樣品中阿魏酸的含量分別為 0.236，0.245，0.267 mg/g。

2.3 芍藥苷含量測定

2.3.1 色譜條件

色譜柱:大連依利特 Hypersil ODS2柱(150 mm×4.6 mm，5 μm);流動相:乙腈 －0.1%磷酸溶液(14∶86);流速:1 mL/min;柱溫:30℃;檢測波長:232 nm;進(jìn)樣量:10 μL。理論塔板數(shù)按芍藥苷計(jì)算應(yīng)不低于2 000。

2.3.2 溶液制備

精密稱取芍藥苷對照品10.3 mg，置 200 mL 棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每 1 mL 含 51.5 μg的溶液，即得對照品溶液。精密稱取樣品0.8 g，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，放置過夜，超聲處理40 min，放冷，稱定質(zhì)量，用稀乙醇補(bǔ)足損失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3.3 方法學(xué)考察

陰性干擾試驗(yàn):取缺白芍的陰性對照樣品，按供試品溶液制備方法制備，進(jìn)樣，測定。結(jié)果表明處方中其他藥味無干擾。見圖3。

圖3 芍藥苷高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察:分別精密吸取對照品溶液 4，8，10，12，16 μL，按上述色譜條件進(jìn)樣測定，以對照品峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣量(X，μg)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=1 301 751 X －11 971.65，r=0.999 8(n=5)。結(jié)果表明，芍藥苷進(jìn)樣量在0.206～0.824 μg范圍內(nèi)與峰面積積分值線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn):精密吸取對照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，依法測定。結(jié)果芍藥苷峰面積積分值平均值為651 257，RSD=0.45%(n=5)，表明方法精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn):取同一批號樣品(100802)6份，依法測定。結(jié)果芍藥苷平均含量為 1.023 mg/g，RSD=1.07%(n=6)，表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一供試品溶液，分別在 0，2，4，6，8，12 h 時(shí)進(jìn)樣(10 μL)，依法測定。結(jié)果峰面積積分值 RSD=0.87%(n=6)，表明供試品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn):取已知含量的樣品(批號為100802)6份，精密稱定，精密加入一定量芍藥苷對照品，按供試品溶液制備方法制備，依法測定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表2。

表2 芍藥苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.3.4 樣品含量測定

分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀測定，以外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果批號為100623，100701，100714的 3 批樣品中芍藥苷含量分別為 1.023，1.034，1.042 mg/g。

3 討論

阿魏酸的含量測定參考文獻(xiàn)[1]中方法，采用流動相乙腈－0.085%磷酸溶液(17∶83)或流動相乙腈－0.6 mol/L醋酸溶液(30∶70)，結(jié)果采用流動相乙腈－0.085%磷酸溶液(17∶83)時(shí)阿魏酸可以基線分離不受其他組分干擾，分離效果好，準(zhǔn)確度高。芍藥苷的含量測定參考文獻(xiàn)[3]中方法，采用流動相甲醇－0.05 mol/L磷酸二氫鉀(30∶70)、流動相乙腈 －0.1%磷酸(14∶86)、流動相乙腈－0.2%磷酸(14∶86)，結(jié)果芍藥苷采用流動相乙腈－0.1%磷酸(15∶85)時(shí)可以基線分離不受其他組分干擾，分離效果好，準(zhǔn)確度高。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:124，1 014，606，593.

[2]廉 蓮，賈天柱.回生第一丹質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究[J].中成藥，2008，30(12):220.