李君君楊 錦夏志月歐陽健明*,
(1廣東藥學(xué)院藥科學(xué)院,廣州 510006)
(2暨南大學(xué)生物礦化與結(jié)石病防治研究所,廣州 510632)
草酸鈣的結(jié)晶動(dòng)力學(xué)及不同種類羧酸鹽的影響
李君君1,2楊 錦2夏志月2歐陽健明*,2
(1廣東藥學(xué)院藥科學(xué)院,廣州 510006)
(2暨南大學(xué)生物礦化與結(jié)石病防治研究所,廣州 510632)
通過檢測體系中游離Ca2+離子濃度及草酸鈣(CaOxa)的粒徑隨時(shí)間的變化,研究了CaOxa的結(jié)晶動(dòng)力學(xué)及3種羧酸鹽對CaOxa結(jié)晶動(dòng)力學(xué)的影響,這些羧酸鹽為:一元羧酸鹽甘氨酸鈉(NaGlu)、二元羧酸鹽酒石酸鈉(Na2Tart)和三元羧酸鹽檸檬酸三鈉(Na3Cit)。在生理鹽水中 CaOxa 的結(jié)晶動(dòng)力學(xué)方程為 r=kc3.3±0.3,平均反應(yīng)速率常數(shù)(k)為(3.1±1.8)×109;3 種抑制劑對 k 的影響程度從大到小為:Na3Cit>Na2Tart>NaGlu,但其平均反應(yīng)級(jí)數(shù)(α)相差不大,α=3.2±0.1。Na3Cit、Na2Tart可抑制 CaOxa 晶體的生長和聚集過程,是潛在的腎結(jié)石抑制劑。
草酸鈣;結(jié)晶動(dòng)力學(xué);羧酸鹽;反應(yīng)級(jí)數(shù);ζ電位
腎結(jié)石是人體內(nèi)的病理礦化所致,其主要組分為草酸鈣(CaOxa)。CaOxa結(jié)石的形成涉及微晶的成核、生長、聚集和粘附等過程。由于人體內(nèi)部環(huán)境相當(dāng)復(fù)雜,很難在原位進(jìn)行觀測,因此一般都采取體外模擬的方法來研究CaOxa的成核、生長、聚集及各種抑制劑對這些過程的影響,這些體外模擬體系包括水[1]、尿液[2-3]、合成尿[4]、膜模擬體系[5]和腎上皮細(xì)胞表面[6]等。
前人在進(jìn)行CaOxa結(jié)晶過程的動(dòng)力學(xué)研究時(shí),常常采用光密度(OD值)法[7]、微量熱法[8]和動(dòng)力學(xué)恒組分法[9]等方法。例如,Kulaksizoglu等[7]通過測定體系在620 nm時(shí)的光密度(OD值),研究了檸檬酸三鈉、檸檬汁和橙汁對一水草酸鈣(COM)晶體生長的影響,它們均能抑制COM晶體的成核和聚集,歸因于檸檬酸中帶負(fù)電的羧基能夠快速的吸附在CaOxa晶體的表面,使得溶液中形成的亞臨界晶核又逐步溶解。沈玉華等[10]通過跟蹤體系中Ca2+濃度的變化,研究了Mg2+、賴氨酸和醋酸對CaOxa結(jié)晶動(dòng)力學(xué)的影響,表明在生理鹽水體系中,它們均對CaOxa的結(jié)晶生長起抑制作用。童華等[8]采用微量熱法、X射線衍射(XRD)及掃描電鏡(SEM)法研究了Sm3+對CaOxa結(jié)晶過程動(dòng)力學(xué)的影響效應(yīng),證實(shí)Sm3+對CaOxa晶體初期成核以及晶體生長有抑制作用。Nancollas等[11]采用恒組分法研究了在檸檬酸鹽存在下COM的結(jié)晶動(dòng)力學(xué)過程,發(fā)現(xiàn)COM的生長速率依賴于溶液的過飽和度以及檸檬酸鹽的濃度。在COM-檸檬酸鹽體系中,COM的結(jié)晶行為符合經(jīng)典的Cabrera-Vermilyea模型;當(dāng)過飽和溶液的相對過飽和度(RS)分別為 21.43 和 24.65,且存在比表面積為3.3 m2·g-1的COM種晶時(shí),COM的生長速率分別為 4.77×10-6和 1.97×10-5mol·m-2·min-1; 當(dāng)檸檬酸鹽濃度為0.01 mmol·L-1時(shí),對COM晶體的生長速率無顯著影響,但當(dāng)檸檬酸鹽濃度增至0.1 mmol·L-1和 1.0 mmol·L-1時(shí),對 COM 晶體生長的抑制能力分別為50%和93%。即:檸檬酸鹽吸附在COM晶體表面的扭折處 (kinks)、邊緣以及臺(tái)階表面,阻礙臺(tái)階的生長,從而降低其生長速率。
同上述方法相比,電極法是采用離子選擇電極,通過測量體系的電動(dòng)勢從而檢測出溶液中離子的活度隨時(shí)間的變化,電極法具有快速、靈敏度高、設(shè)備簡單、用量少、可測范圍寬 (一般為10-5~10-1mol·L-1,個(gè)別可達(dá) 10-8mol·L-1)等優(yōu)點(diǎn)。通過對晶體結(jié)晶過程中不同時(shí)刻結(jié)晶體系的電極電位進(jìn)行實(shí)時(shí)測量,不但可以研究結(jié)晶的動(dòng)力學(xué)過程,而且可以計(jì)算過程中的物理化學(xué)參數(shù)變化。將電極法應(yīng)用于研究CaOxa的結(jié)晶動(dòng)力學(xué)過程及其參數(shù)測定還鮮有報(bào)道。
由于尿液體系很復(fù)雜,加上人體內(nèi)其它因素的影響,因此,原位研究CaOxa結(jié)石形成的動(dòng)力學(xué)過程存在一定的難度[12]。但是,CaOxa晶體從過飽和的尿液中結(jié)晶析出時(shí),其結(jié)晶過程可描述為:
由于當(dāng)體系中CaOxa晶體析出時(shí),溶液中游離的Ca2+離子濃度會(huì)減少,因此,通過檢測體系中Ca2+離子濃度的下降速率可以研究其結(jié)晶速率。
尿液過飽和是尿結(jié)石形成的先決條件。而尿液中存在的抑制物不但可以減小CaOxa的相對過飽和度(RS),而且可吸附在尿石鹽晶體的表面,封閉尿石鹽晶體表面的活性生長位點(diǎn),改變晶體表面的電荷及能量分布,從而改變晶體生長的動(dòng)力學(xué)過程。此外,晶體生長速率的減小還與其表面上有效生長點(diǎn)被抑制劑覆蓋百分率成正比。對于羧酸類抑制劑,其所含的COOH數(shù)量會(huì)影響其與Ca2+的配位能力[13],預(yù)計(jì)其對CaOxa結(jié)晶動(dòng)力學(xué)的影響程度也不同。因此,本文采用電極法研究了CaOxa的結(jié)晶動(dòng)力學(xué)及一元、二元和三元羧酸鈉的影響,探討了其抑制機(jī)理,期望可為抑制CaOxa結(jié)石的形成提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
甘氨酸鈉(NaGlu)、酒石酸鈉(Na2Tart)、檸檬酸三鈉(Na3Cit)等化學(xué)品均為分析純,實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。
232型飽和KCl甘汞參比電極、PCa-1型鈣離子選擇性電極和PHS-3C型精密pH計(jì)均購置于上海精密科學(xué)儀器有限公司;DF-Ⅱ集熱式磁力加熱攪拌器(江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠);英國Malvern公司Zetasizer Nano-ZS型納米粒度儀。
將鈣離子電極與甘汞電極組成下述測量電池:
Hg,HgCl2|KCl(飽和)|試液|敏感膜|1.0 mmol·L-1鈣標(biāo)準(zhǔn)液|Ag,AgCl
其中試液為待測溶液;敏感膜是以二對異辛基苯基磷酸鈣為活性材料的PVC膜。鈣離子電極在使用前,先浸泡在1.0 mmol·L-1鈣標(biāo)準(zhǔn)液中活化24 h,再用去離子水清洗電極頭部至空白值為-65 mV后使用。
鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:分別配制濃度為100、10、1、0.1 和 0.01 mmol·L-1的 CaCl2溶液,由于尿液的離子強(qiáng)度 I=0.15 mol·L-1,故在生理鹽水(0.15 mol·L-1NaCl)中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將參比電極和鈣電極分別接在精密pH計(jì)的正負(fù)極上,組成測量電池。在pH計(jì)上讀出不同濃度鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液(cCa2+)所對應(yīng)的E值,然后以lgcCa2+
為橫坐標(biāo)、E為縱坐標(biāo)作圖,得到Ca2+離子標(biāo)準(zhǔn)曲線。
尿液中的鈣有兩種形式:配合鈣 (如蛋白結(jié)合鈣、有機(jī)酸結(jié)合鈣)和游離鈣。但只有游離鈣才具有生理活性,游離鈣的濃度也是影響結(jié)石形成的重要因素之一。根據(jù)Von Weimarn經(jīng)驗(yàn)公式,(Q-s)/s為沉淀開始時(shí)瞬間的相對過飽和度(RS),其中Q為加入沉淀劑瞬間沉淀物質(zhì)的濃度,s為開始沉淀時(shí)沉淀物質(zhì)的溶解度,Q-s為沉淀開始瞬間的過飽和度。根據(jù)文獻(xiàn)[14],男女尿液中的離子鈣分別為(48.2±25.5)mg·L-1[(1.21±0.64)mmol·L-1]和(42.2±21.1)mg·L-1[(1.06±0.53)mmol·L-1],Oxa2-的濃度為(0.53±0.20)mmol·L-1[15],因此,男女尿液中的 CaOxa的RS 分別為 15.25±10.81 和 14.21±9.75?;谏鲜?RS 范圍考慮,本實(shí)驗(yàn)在生理鹽水中配制濃度分別為1.2、1.0和 0.8 mmol·L-1的 3 種 CaOxa 過飽和溶液,即 cCa2+=cOxa2-=1.2、1.0 和 0.8mmol·L-1。根據(jù) Ksp(CaOxa)=2.32×10-9,這些溶液的 RS 分別為 23.91、19.76 和 15.61。
以RS=19.76的CaOxa過飽和溶液為例:取5 mL 10 mmol·L-1的CaCl2溶液與40 mL生理鹽水混合均勻,在勻速攪拌下,迅速加入5 mL 10 mmol·L-1K2Oxa溶液。然后測定溶液中Ca2+的E值隨時(shí)間(t)的變化,再由線性回歸方程計(jì)算出溶液中游離Ca2+的平均濃度cCa2+,實(shí)驗(yàn)溫度(37±1)℃。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
同上實(shí)驗(yàn),在RS=15.61的CaOxa過飽和溶液中,分別加入 NaGlu、Na2Tart或 Na3Cit,其最終濃度為 2.0 mmol·L-1。反應(yīng)不同時(shí)間 (t=1、5、10、20、40、60 min)后對溶液抽樣,采用納米粒度儀檢測體系中CaOxa微晶的粒徑和ζ電位。在反應(yīng)過程中用濃度為 0.01 mol·L-1的稀 HCl或稀 NaOH 溶液維持體系的 pH=6.0±0.02。取 3 次結(jié)果的平均值。
采用XRD作定量分析時(shí),按照文獻(xiàn)[16]方法計(jì)算一水草酸鈣(COM)、二水草酸鈣(COD)和三水草酸鈣(COT)的百分含量。以COM為例,其百分含量為:
式中ICOM、ICOD和ICOT分別為COM、COD和COT最強(qiáng)衍射峰的強(qiáng)度,實(shí)驗(yàn)誤差一般在5%以下。
在濃度為 0.1~100 mmol·L-1范圍內(nèi),鈣離子電極對Ca2+離子有較理想的能斯特響應(yīng)和較好的重現(xiàn)性。其線性回歸方程為:E=67.5+28.3lgcCa2+,相關(guān)系數(shù)為 0.9999。
調(diào)節(jié)1.0 mmol·L-1鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液的pH值分別為4、5、6、7、8 和 9,并逐一測定其 E 值,3 次結(jié)果平均值 依 次為-23.5、-22、-21.5、-21.5、-21.5 和 -24.5 mV。即:在pH為5~8范圍內(nèi),E值比較穩(wěn)定;但當(dāng)pH<5或pH>8時(shí)偏離較大。這是由于在pH<5的體系中,H+濃度較大,對鈣離子選擇性電極的選擇性有著明顯的干擾;而在pH>8的體系中,OH-濃度較大,高濃度的OH-與Ca2+形成難離解的Ca(OH)2(aq)甚至 Ca(OH)2沉淀。本實(shí)驗(yàn)體系的 pH=6.0±0.02,在此pH范圍內(nèi),不但E值穩(wěn)定,而且pH處在尿液的pH變化范圍之內(nèi)。
(1)CaOxa結(jié)晶過程動(dòng)力學(xué)方程的建立:為了建立CaOxa結(jié)晶的動(dòng)力學(xué)方程,在按等物質(zhì)的量配制的CaOxa過飽和溶液中,假設(shè)Ca2+與Oxa2-等量反應(yīng),則反應(yīng)速率(r)方程為:
假設(shè)x為t時(shí)刻Ca2+或Oxa2-的消耗量,且p+q=α,由于 cCa2+=cOxa2-=c,且按等比反應(yīng),對(1)整理得:
結(jié)合(1)、(2)、(3)式,并兩邊取對數(shù),整理得:
式中a、c為溶液中初始(t=0)、t時(shí)刻的游離cCa2+(mmol·L-1),x為 t時(shí)刻溶液中 Ca2+的消耗量 (mmol·L-1),α為反應(yīng)的級(jí)數(shù),k為反應(yīng)速率常數(shù)。由(4)式可知,lgr與lg(a-x)呈線性關(guān)系,直線的斜率即為反應(yīng)的級(jí)數(shù)α,截距為lgk,進(jìn)而可求得反應(yīng)的速率常數(shù)k。
(2)反應(yīng)速率常數(shù)與反應(yīng)級(jí)數(shù)的測定:圖1所示為在3種不同RS的CaOxa溶液中,游離cCa2+隨反應(yīng)時(shí)間(t)的變化??梢?,體系中l(wèi)gcCa2+均隨反應(yīng)時(shí)間的延長而下降,且在0~10 min下降較快,20 min后下降趨于緩和。這是由于在反應(yīng)初期,溶液的RS較大,CaOxa大量成核,導(dǎo)致cCa2+快速下降。20 min后cCa2+下降較慢,表明此時(shí)體系中CaOxa已接近沉淀-溶解平衡。
在過飽和的尿液中,尿石鹽成核是尿結(jié)石形成的第一步。若假設(shè)形成的臨界晶核為球形,臨界半徑 r,則晶核形成的 Gibss 自由能(ΔGr′)可描述為[17]:
圖1 在不同RS的CaOxa溶液中l(wèi)gcCa2+-t關(guān)系圖Fig.1 lgcCa2+-t curves in CaOxa solution with different relative suprasaturation degree(RS)
其中σ為單位表面的表面能;V為物質(zhì)的量體積;RS為溶液的相對過飽和度。
上式(5)表明,ΔGr′與lnRS的平方成反比。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長,溶液中被消耗的cCa2+迅速增加。例如,在t=15 min時(shí),體系中游離cCa2+分別由 1.2、1.0、0.8 mmol·L-1減小到 0.18、0.17 和 0.17 mmol·L-1,RS也由反應(yīng)前的23.91、19.76 和 15.61分別下降至2.74、2.53 和 2.53;t=60 min 時(shí) RS 則分別降至 1.81、2.12 和 1.92。由于 RS<10的CaOxa 溶液不會(huì)自發(fā)結(jié)晶,因此,15 min后CaOxa的自發(fā)成核在熱力學(xué)上不可能進(jìn)行,故反應(yīng)初期lgcCa2+隨時(shí)間的下降主要是歸因于CaOxa的成核。晶體的成核速率不但與溶液的 RS 成正比[18],并與 exp[-ΔGr′/(KT)]成正比[19]。
圖2為在3種不同RS的CaOxa過飽和溶液中所形成晶體的 XRD 圖。當(dāng) RS=15.61(圖 2c)和 19.76(圖2b)時(shí),只檢測到歸屬于一水草酸鈣(COM)的衍射峰,其晶面間距d分別在0.590、0.362、0.296、0.248、0.235、0.207 和0.198 nm,依次歸屬于COM的(01)、(020)、(02)、(112)、(130)、(321)和(03)晶 面(ASTM 卡號(hào):20-0231)。
而當(dāng) RS=23.91 時(shí)(圖 2a),除檢測到 COM 的衍射峰外,還檢測到 d=0.546、0.525 nm 歸屬于三水草酸鈣(COT)的(110)、(011)晶面(ASTM 卡號(hào):20-0232)和 d=0.263、0.220 nm 歸屬于二水草酸鈣 (COD)的(312)、(213)晶面的衍射峰(ASTM 卡號(hào):20-0233)。定量計(jì)算表明,COM、COD、COT 分別占 60.7%、17.9%、21.4%。前文[19]報(bào)道,以結(jié)石患者的稀釋尿液為介質(zhì),在RS=23.91的CaOxa溶液中結(jié)晶1 d后,同時(shí)形成了COM、COT兩種晶相;本實(shí)驗(yàn)在生理鹽水體系中反應(yīng)15 min后,亦同時(shí)出現(xiàn)了COT、COD和COM。這表明,在RS較高的CaOxa溶液中,容易生成熱力學(xué)不穩(wěn)定的晶相COD和COT,且常常得到COT和COD的混 合 物[20]。而 在 RS為 19.76 和 15.61 的CaOxa溶液中,則形成熱力學(xué)穩(wěn)定的COM。由Ostwald規(guī)則可知,當(dāng)某種物質(zhì)的幾種晶相都可能生成時(shí),則具有較高溶解度的晶相在動(dòng)力學(xué)上有利的,由于CaOxa 3種晶相的溶解度大小順序?yàn)椋篊OT>COD>COM[21],因此,COT 優(yōu)先生成;實(shí)際上,COT 常常是CaOxa結(jié)石形成過程中的先驅(qū)體[20]。
圖2 在不同RS的CaOxa溶液中形成晶體的XRD圖Fig.2 XRD patterns of CaOxa crystallites formed in CaOxa solution with different RS
圖3 不同RS的CaOxa溶液中l(wèi)gr-lg(a-x)關(guān)系圖Fig.3 lgr-lg(a-x)curves in CaOxa solution with different RS
采用微分法,以Ca2+消耗量(xCa2+)對反應(yīng)時(shí)間(t)作圖,曲線上任意一點(diǎn)的斜率(由Origin數(shù)據(jù)分析軟件求導(dǎo)所得)即為該反應(yīng)的速率 (r)。然后以lgr對lg(a-x)作圖(圖3),所得直線的斜率即為該反應(yīng)的級(jí)數(shù)(α);通過截距(lgk)可求得反應(yīng)速率常數(shù)(k),其結(jié)果均見表1??梢钥闯?,雖然CaOxa溶液的RS不同,但其α相差不大,而k略有不同。根據(jù)Eyring公式:可知,△Gr′越小,k 越大。COT 比COD和COM的溶解度大,且水合草酸鈣的溶解速率常數(shù)(k′)大小順序?yàn)?k′COT>k′COD>k′COM[5],因此,COT的臨界晶核形成自由能△Gr′比COD和COM的??;由于溶液中CaOxa晶體的形成和溶解是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡過程,則形成不同晶相的反應(yīng)速率常數(shù)k的大小順序?yàn)椋簁COT>kCOD>kCOM。這一結(jié)果與 XRD 結(jié)果(圖2)一致,因?yàn)樵赗S=23.91時(shí),體系中同時(shí)形成了COM、COD 和 COT;而當(dāng) RS為 19.76 和 15.61 時(shí),溶液中均只存在COM。因此,在RS=23.91時(shí)得到的k 值(4.9×109)比 RS=19.76 和 15.61 時(shí)的大;且后兩者的 k 值差異不大,分別為 2.1×109和 2.3×109。
綜上所述,在生理鹽水中,CaOxa結(jié)晶動(dòng)力學(xué)的平均反應(yīng)級(jí)數(shù))為 3.3±0.3,平均反應(yīng)速率常數(shù)(k)為(3.1±1.8)×109。
表1 不同RS的CaOxa過飽和溶液在結(jié)晶時(shí)的反應(yīng)級(jí)數(shù)及反應(yīng)速率常數(shù)Table 1 Reaction orders and rate constants of CaOxa crystallization in supersaturated solution with different RS
2.3.1 甘氨酸鈉的影響
圖4A為加入 2.0 mmol·L-1的不同羧酸鈉后,體系中l(wèi)gcCa2+隨時(shí)間變化的曲線。與空白組(圖4A(a))相比較,加入 NaGlu 后(圖 4A(b)),在 1~15 min 內(nèi),其游離的cCa2+比空白組小,這是由于加入NaGlu后,不僅Oxa2-與Ca2+結(jié)合形成CaOxa沉淀,Glu-也會(huì)與Ca2+配位,從而導(dǎo)致在反應(yīng)的初始的階段,游離的cCa2+較小。15 min后,兩者差異不大,說明此時(shí)NaGlu對CaOxa的結(jié)晶動(dòng)力學(xué)影響較小。
圖4 加入2.0 mmol·L-1的不同抑制劑后CaOxa過飽和溶液中的lgcCa2+-t變化曲線(A)和CaOxa粒徑隨時(shí)間的變化圖(B)Fig.4 (A)lgcCa2+-t curves and(B)the sizes of CaOxa crystallites over time in CaOxa solution in presence of different inhibitors of 2.0 mmol·L-1
晶體成核速率與溶液中CaOxa的RS成正比。在反應(yīng)初期,由于溶液的RS較大,CaOxa晶核形成的Gibss自由能ΔGr′很負(fù),此時(shí)形成晶核所需跨越的能壘較低,成核速率較快;但隨著反應(yīng)的進(jìn)行,CaOxa的RS逐漸減小,成核速率減慢。
采用納米粒度儀(圖4B)研究了加入NaGlu后CaOxa粒徑隨時(shí)間的變化(圖4B(b))。在前10 min內(nèi),CaOxa微晶的平均粒徑 ()由1 111 nm增加到1 426 nm,60 min時(shí),其增加至2623 nm;而空白組在60 min時(shí)的=3377 nm,粒徑增加歸因于在反應(yīng)后期微晶的生長和聚集所致。
加入NaGlu后,反應(yīng)60 min所形成的CaOxa微晶的ζ電位為-(1.58±0.19)mV,小于空白組的(1.41±0.16)mV。
由以上分析可知,在反應(yīng)初期,CaOxa是以成核為主,而在反應(yīng)后期,CaOxa以生長和聚集為主。
2.3.2 酒石酸鈉的影響
圖4A(c)為在Na2Tart存在下lgcCa2+隨反應(yīng)時(shí)間的變化曲線,可見其游離cCa2+比空白組和NaGlu組均小。Na2Tart為二元羧酸鹽,其與Ca2+的配位能力強(qiáng)于NaGlu。Oxa2-與Ca2+螯合時(shí)形成1∶1的配合物,其穩(wěn)定常數(shù)(Ks)為 103.0;而 Tart2-與 Ca2+螯合時(shí),形成 2∶1的配合物[22],Ks為 109.01。由于在溶液中生成CaOxa微晶的必要條件為:cCa2+cOxa2-≥Ksp,而加入 2.0 mmol·L-1的 Na2Tart后,不但導(dǎo)致 Ca2++Oxa2-?CaOxa平衡向左移動(dòng),即CaOxa溶解,而且體系中的游離cCa2+由最初的0.8 mmol·L-1顯著下降至15 min 后的 0.14 mmol·L-1(圖 4A(c))。
加入Na2Tart并反應(yīng)10 min后,CaOxa微晶的由1 min時(shí)的821 nm增加到1073 nm(圖4B(c)),增幅不大;而反應(yīng)60 min后,=2209 nm,其ζ電位為-(2.73±0.17)mV,說明Na2Tart對CaOxa晶體的成核、生長及聚集均有抑制作用,且其抑制能力大于NaGlu。
2.3.3 檸檬酸三鈉的影響
圖4A(d)為在Na3Cit存在下lgcCa2+隨時(shí)間的變化曲線,其游離cCa2+比加入NaGlu、Na2Tart的要小得多。其原因是由于Na3Cit為三元羧酸鹽,在pH=6.0時(shí)可以與Ca2+形成含有一個(gè)五元環(huán)和一個(gè)六元環(huán)的配合物 (檸檬酸鈣),其Ks=104.68,大于CaOxa的Ks(103.0)[22],且形成的檸檬酸鈣在水中的溶解度很大。實(shí)際上,在加入2.0 mmol·L-1的Na3Cit后,即使反應(yīng)60 min肉眼仍然看不到體系中存在任何沉淀。
在反應(yīng)15 min后,體系中的游離cCa2+下降至0.09 mmol·L-1,遠(yuǎn)小于加入NaGlu和Na2Tart后的0.16 和 0.14 mmol·L-1。這說明 Na3Cit與 Ca2+配位的能力強(qiáng)于Na2Tart和NaGlu。
在反應(yīng)60 min后,CaOxa的 d=897 nm(圖 4B(d)),ζ電位為-3.82±0.08 mV,均比空白組的[3 377 nm,(1.41±0.16)mV]小得多。說明 Na3Cit延緩了CaOxa的生長和聚集速度,且其抑制CaOxa微晶成核、生長及聚集的能力均大于Na2Tart和NaGlu。
2.3.4 三種羧酸鹽對CaOxa生長動(dòng)力學(xué)影響的比較
表2列出了加入不同種類羧酸鹽后CaOxa的結(jié)晶動(dòng)力學(xué)參數(shù)。在加入NaGlu、Na2Tart或Na3Cit后,其由空白組的(3.1±1.8)×109分別降低到 2.0×107、2.0×106和 1.0×106,但其反應(yīng)級(jí)數(shù)(α)相差不大,=3.2±0.1。由于的大小直接反映了反應(yīng)速率的快慢,且與反應(yīng)歷程有關(guān),因此,羧酸鹽的加入,改變了CaOxa的結(jié)晶動(dòng)力學(xué)過程和反應(yīng)歷程。
表2 在三種羧酸鹽存在下CaOxa過飽和溶液在結(jié)晶時(shí)的平均反應(yīng)級(jí)數(shù)()及反應(yīng)速率常數(shù)(k)(37℃)*Table 2 Average reaction ordersand rate constants()of CaOxa crystallization in presence of three different carboxylates*
表2 在三種羧酸鹽存在下CaOxa過飽和溶液在結(jié)晶時(shí)的平均反應(yīng)級(jí)數(shù)()及反應(yīng)速率常數(shù)(k)(37℃)*Table 2 Average reaction ordersand rate constants()of CaOxa crystallization in presence of three different carboxylates*
*RS of CaOxa solution is 15.61,Concentration of carboxylates is 2.0 mmol·L-1.
Inhibitor Blank NaGlu Na2Tart Na3Cit k 3.3±0.3 3.3 3.1 3.1 COM/% 100 100 12.5 —COD/% 0 0 18.8 —COT/% 0 0 68.7 —(3.1±1.8)×1092.0×1072.0×1061.0×106α
NaGlu、Na2Tart和 Na3Cit對 CaOxa生長動(dòng)力學(xué)的抑制作用歸因于如下原因:
(1)它們可以附著在CaOxa晶體的活性生長位點(diǎn)處,從而抑制CaOxa的生長和聚集;特別是Tart2-、Cit3-中的羧基和羥基可以與COM晶體中一些晶面上的鈣配位,如Tart2-、Cit3-中的羧基間距離與COM的(101)晶面中的Ca2+-Ca2+距離較為匹配[23],因此,阻止了Oxa2-向該晶面遷移,從而抑制了該晶面的生長(參見圖5c)。從衍射峰的強(qiáng)度也可以看出,加入Na2Tart后生成的COM的(101)晶面的強(qiáng)度明顯弱于加入NaGlu和空白組。Cody等[23]分析了面積為1.6 nm×1.6 nm的COM、COD和COT的晶面,對于負(fù)二價(jià)的酒石酸根離子,在COM晶格中可找到8個(gè)可能的吸附位點(diǎn),在COT晶格中可找到5個(gè),而在COD只有3個(gè)。由于COM在單元面積里包含較多的吸附位點(diǎn),因此,COM具有最強(qiáng)的吸附能力,這也是Na2Tart和 Na3Cit抑制 COM、誘導(dǎo)COD、COT形成的本質(zhì)所在。
圖5 不同抑制劑存在下CaOxa溶液中形成的晶體的XRD圖(A)及3種抑制劑標(biāo)準(zhǔn)物的XRD圖(B)Fig.5 XRD patterns of CaOxa crystallites formed in presence of different inhibitors and those of the three kinds of inhibitors
(2)本實(shí)驗(yàn)的弱酸性環(huán)境(pH=6.0±0.02)也有利于抑制CaOxa晶體的沉淀。因?yàn)樵诖藀H時(shí),H+可以與體系中的Oxa2-結(jié)合形成HOxa-,使得Ca2++Oxa2-?CaOxa平衡向左移動(dòng),導(dǎo)致CaOxa晶體的生成速度以及沉淀量均減小。
(3)在生理鹽水體系中,加入Na2Tart和Na3Cit后,由于Tart2-、Cit3-中所含的COO-與溶液中的Ca2+配位,而Ca2+又吸附溶液中的Oxa2-,使得體系中局部CaOxa的RS比本體溶液的大,由公式(5)可知,RS 越大,形成晶核的 Gibss自由能(ΔGr′)越小,越容易成核。
此外,由于COT、COD和COM的溶解速率常數(shù)(k′)大小為 k′COT>k′COD>k′COM[5],而形成不同晶相的反應(yīng)速率常數(shù) k 的大小順序?yàn)?表 2):kCOT>kCOD>kCOM,根據(jù)前述Eyring公式可知,臨界晶核形成自由能ΔGr′為:ΔGr′COT<ΔGr′COD<ΔGr′COM。因 此,Na2Tart和Na3Cit的加入,抑制了體系中最先形成的COT和COD向COM的轉(zhuǎn)化。
圖5為加入不同抑制劑后形成的CaOxa晶體的XRD圖。對照組(圖5a)和加入NaGlu(圖5b)后均只檢測到 COM(d=0.590、0.362、0.296、0.235、0.198 nm)的衍射峰,歸屬于NaGlu的主衍射峰(d=0.957 nm)和 2 個(gè)次衍射峰(d=0.489 和 0.422 nm)均消失(圖5d)。而加入Na2Tart后,除檢測到COM外,還檢測到歸屬于 COT 晶體 (d=0.664、0.546、0.525、0.264 nm 分別對應(yīng)其(100)、(110)、(011)、(131)面)和 COD 晶體 (d=0.334、0.285、0.277 nm 分別對應(yīng)其 (112)、(222)、(411)面)的衍射峰(圖 5c),定量分析表明,其組成 比 約為:COM∶COD∶COT=12∶19∶69; 而 歸 屬 于Na2Tart的衍射峰(d=0.538、0.488、4.19、0.367、0.234、0.213、0.195 nm)均消失(圖 5e)。
加入 Na3Cit后,不但 k 最小(1.0×106),表明其反應(yīng)速率最慢,而且一直沒有觀察到沉淀出現(xiàn),說明Na3Cit抑制CaOxa成核、生長和聚集的能力最強(qiáng)。
研究了CaOxa的結(jié)晶動(dòng)力學(xué)及不同羧酸鹽的影響。在 RS=15.61~23.91 范圍內(nèi),CaOxa 的結(jié)晶動(dòng)力學(xué)方程為 r=kc3.3±0.3,平均反應(yīng)級(jí)數(shù) α=3.3±0.3,平均反應(yīng)速率常數(shù) k=(3.1±1.8)×109。加入 NaGlu、Na2Tart和 Na3Cit后,其 α=3.2±0.1,差異不大,但 k 分別降低到 2.0×107、2.0×106和 1.0×106,說明本實(shí)驗(yàn)中羧酸鈉的加入降低了CaOxa的反應(yīng)速率。不同抑制劑對抑制CaOxa成核、生長及聚集的能力為:Na3Cit>Na2Tart>NaGlu>空白組。
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Crystallization Kinetics of CaOxa and the Influence of Different Carboxylic Acid Salt
LI Jun-Jun1,2YANG Jin2XIA ZHI-Yue2OUYANG Jian-Ming*,2
(1College of Pharmacy,Guangdong Pharmaceutical University,Guangzhou 510006,China)
(2Institute of Biomineralization and Lithiasis Research,Jinan University,Guangzhou 510632,China)
The kinetics of calcium oxalate (CaOxa)crystallization and the effect of three carboxylates were studied by determining the changes of free Ca2+ions concentration and the size of CaOxa crystallites with the reaction time.These carboxylates were monocarboxylic acid salt(NaGlu),dicarboxylic acid salt(Na2Tart),and tricarboxylic acid salt(Na3Cit),respectively.The dynamics equations of calcium oxalate crystallization in normal saline was r=kc3.3±0.3,the average reaction rate constant(k)was (3.1±1.8)×109.The effect of three inhibitors on k values was in the order from large to small:Na3Cit>Na2Tart>NaGlu>blank.However,there is little difference for the average reaction order (α)value and α=3.2 ±0.1.Since Na3Cit and Na3Tart can inhibit the growth and aggregation of CaOxa crystals,they may be potential inhibitors for formation of kidney stones.
calcium oxalate;crystallization kinetics;carboxylate;reaction order;ζ potential
O614.23+1;O643.13+2;O743+3
A
1001-4861(2012)06-1091-08
2011-12-21。收修改稿日期:2012-02-21。
國家自然科學(xué)基金(No.81170649)和廣東省科技攻關(guān)課題(No.2009B030801236)資助項(xiàng)目。
*通訊聯(lián)系人。E-mail:toyjm@jnu.edu.cn