Dyrk1A經(jīng)ASF調(diào)控CaMKⅡδ可變剪接在腎血管性高血壓大鼠心肌肥厚中的作用*

姚 健， 朱健華， 陸盡亞，3， 秦曉同， 于小紅， 盛紅?！?/p>

(南通大學(xué)1附屬醫(yī)院心內(nèi)科，2醫(yī)學(xué)院組胚教研室，3南通市第一人民醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科，江蘇南通226001)

心肌肥厚是心肌細(xì)胞對多種心血管刺激的代償性反應(yīng)，可由壓力超負(fù)荷、損傷和神經(jīng)激素活化引起［1］。心肌肥厚可導(dǎo)致多種心血管意外如心肌梗死、心律失常、心衰等的發(fā)生率顯著增加，預(yù)防心肌肥厚可以明顯改善心臟病患者的預(yù)后。

鈣/鈣調(diào)素依賴蛋白激酶Ⅱ(calcium/calmodulin－dependent protein kinaseⅡ，CaMKⅡ)是介導(dǎo)心肌肥厚的重要激酶［2］。心臟組織中主要表達(dá)CaMKⅡ的δ亞型［3］，由于外顯子14、15或者16的可變剪接，CaMKⅡδ可表達(dá)A、B、C 3種亞型，正常機(jī)體內(nèi)CaMKⅡδ的可變剪接受著嚴(yán)格的調(diào)控。可變剪接因子(alternative splicing factor，ASF)在心肌CaMKⅡδ可變剪接的調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用［4］。ASF是受磷酸化高度調(diào)控的蛋白，前期本課題組通過轉(zhuǎn)基因細(xì)胞研究的方法發(fā)現(xiàn)，雙特異性酪氨酸磷酸化調(diào)節(jié)激酶1A(dual－specificity tyrosine phosphorylation－regulated kinase 1A，Dyrk1A)可磷酸化 ASF，從而使其移位，失去對可變剪接的調(diào)控作用［5］，提示存在Dyrk1A經(jīng)ASF調(diào)控CaMKⅡδ可變剪接的信號通路，但該通路在心肌肥厚中的作用尚未見研究報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)利用兩腎一夾(two－kidney one－clip，2K1C)的大鼠心肌肥厚模型，通過檢測大鼠心肌肥厚過程中CaMKⅡδ亞型可變剪接的改變及Dyrk1A、ASF表達(dá)的變化，并分別應(yīng)用Dyrk1A抑制劑——表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)和哈爾堿(harmine)干預(yù)，探討EGCG和哈爾堿對心肌肥厚、CaMKⅡδ可變剪接和ASF、Dyrk1A蛋白表達(dá)的影響，闡明心肌中 Dyrk1A經(jīng) ASF對CaMKⅡδ可變剪接的調(diào)控在腎血管性高血壓大鼠心肌肥厚中的作用。

材料和方法

1 動(dòng)物

采用健康、雄性Sprague－Dawley(SD)大鼠32只，清潔級，體重(174±9)g，購于上海西普爾－必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號為SCXK(滬)2008－0016。

2 方法

2.1 動(dòng)物心肌肥厚模型的制備與分組 大鼠隨機(jī)分為4組:假手術(shù)組(sham組)、兩腎一夾組(2K1C組)、EGCG組和哈爾堿組，每組8只。大鼠以2%戊巴比妥鈉(2 mL/kg)腹腔注射麻醉，從腹部正中切口，分離左腎動(dòng)脈，以直徑0.2 mm的U型銀夾鉗夾左腎動(dòng)脈，右腎動(dòng)脈不觸及。假手術(shù)組不夾左腎動(dòng)脈，其余步驟同手術(shù)組。EGCG組及哈爾堿組大鼠在兩腎一夾基礎(chǔ)上分別喂以EGCG 100 mg·kg－1·d－1和哈爾堿 15 mg·kg－1·d－1，假手術(shù)組和2K1C 組大鼠喂以等量生理鹽水，共8周。

2.2 大鼠血壓、心肌標(biāo)本采集與重量測定 術(shù)后8周，稱取大鼠體重(body weight，BW)，2%戊巴比妥鈉2 mL/kg腹腔注射麻醉后分離左側(cè)頸總動(dòng)脈，插入內(nèi)充有肝素及生理鹽水的導(dǎo)管，記錄動(dòng)脈收縮壓(systolic blood pressure，SBP)和舒張壓(diastolic blood pressure，DBP)，隨后處死大鼠，稱取左心室重量(left ventricular weight，LVW)，計(jì)算左室重與體重比值(LVW/BW);取左室游離壁心肌組織，立即置入10%甲醛中，石蠟包埋切片，Masson染色，以Leica Q550 IW圖像分析儀計(jì)算橫截面跨核的心肌細(xì)胞面積。余左室組織經(jīng)液氮冷凍后于－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 免疫印跡法檢測Dyrk1A和ASF蛋白質(zhì)表達(dá)取大鼠左室心肌組織100 mg，提取心肌胞漿蛋白，BCA法測定蛋白濃度，經(jīng)聚丙烯酰胺變性凝膠電泳分離蛋白，用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到聚氟乙烯膜，5%脫脂牛奶封閉，加Ⅰ抗，4℃過夜，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗，顯色，凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果，以磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)為內(nèi)參照，以目的條帶與GAPDH的吸光度比值表示蛋白表達(dá)水平。小鼠抗大鼠Dyrk1A單克隆抗體由南通大學(xué)神經(jīng)再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室劉飛教授惠贈(zèng);小鼠抗大鼠ASF單克隆抗體、小鼠抗大鼠GAPDH單克隆抗體及共同的羊抗小鼠Ⅱ抗均購自Santa Cruz。

2.4 逆轉(zhuǎn)錄－多聚酶鏈反應(yīng)法檢測CaMKⅡδ可變剪接 取大鼠左室心肌組織50～100 mg，用Trizol法提取RNA，在紫外分光光度計(jì)260 nm處測樣品RNA濃度。取樣品 RNA 5 μg逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA，取cDNA 1 μg行PCR擴(kuò)增。25 μL PCR 反應(yīng)體系:2×PCR MasterMix(北京天根)12.5 μL 、cDNA 1 μg、20 μmol/L 雙向引物各1 μL ，ddH2O 補(bǔ)足至25 μL。凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果，以GAPDH為內(nèi)參照，以目的條帶與GAPDH的吸光度比值表示mRNA表達(dá)水平。反應(yīng)條件為:98℃預(yù)變性5 min，98℃ 30 s，62℃ 45 s，72℃ 45 s，共35 個(gè)循環(huán)，72℃延伸 5 min。引物序列分別為:GAPDH［14］上游引物 5'－ATTGCATCCTGCACCACCAACTGC－3'，下游引物 5'－GGAGGCCATGTAGGCCATGAGGTC－3';CaMKⅡδ上游引物［4］5'－CGAGAAATTTTTCAGCAGCC－3'，下游引物 A［4］5'－ACAGTAGTTTGGGGCTCCAG－3'，下游引物 B［4］5'－GCTCTCAGTTGACTCCATCATC－3'，下游引物 C［4］5'－CTCAGTTGACTCCTTTACCCC－3'。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS Statistics 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，均數(shù)比較采用單因素方差分析及q檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 大鼠心肌肥厚程度及血壓的變化

兩腎一夾術(shù)后8周，2K1C組大鼠收縮壓和舒張壓較假手術(shù)組分別升高了51%和56%(P＜0.05)，提示大鼠高血壓模型制備成功;同時(shí)2K1C組大鼠LVW和LVW/BW較假手術(shù)組升高(P＜0.05)，大鼠心肌病理切片觀察發(fā)現(xiàn)手術(shù)組大鼠心肌細(xì)胞面積較假手術(shù)組增大(P＜0.05)，上述結(jié)果均表明該組大鼠發(fā)生心肌肥厚。與2K1C組相比，EGCG組及哈爾堿組大鼠LVW、LVW/BW及心肌細(xì)胞面積均顯著下降(P＜0.05)，與假手術(shù)組相比無明顯差異，提示EGCG及哈爾堿可以防止腎血管性高血壓大鼠心肌肥厚的發(fā)生;同時(shí)發(fā)現(xiàn)EGCG及哈爾堿組大鼠血壓與2K1C組相似，顯著高于假手術(shù)組(P＜0.05)，提示EGCG和哈爾堿預(yù)防心肌肥厚與血壓無關(guān)，見圖1、表1。

Figure 1.Masson trichrome staining of rat myocardium in different groups.Bar=25 μm.A:sham;B:2K1C;C:EGCG;D:harmine.圖1 各組大鼠心肌Masson染色結(jié)果

表1 大鼠心肌肥厚程度與血壓的變化Table 1.The changes of cardiac hypertrophy and blood pressure in rats(±s.n=8)

表1 大鼠心肌肥厚程度與血壓的變化Table 1.The changes of cardiac hypertrophy and blood pressure in rats(±s.n=8)

*P＜0.05 vs sham group;#P＜0.05 vs 2K1C group.

Group Sham 2K1C EGCG Harmine SBP(mmHg) 119.9 ±21.3 180.8±23.5* 172.0 ±21.6* 174.4±19.7*DBP(mmHg) 75.9±20.1 119.5±17.0* 115.2 ±15.1* 112.4±14.1*LVW(mg) 839.4 ±48.01 062.9 ±71.1* 844.5±57.6# 872.2 ±114.6#LVW/BW(mg/g)2.19±0.22 2.49±0.11* 2.21±0.04# 2.23±0.11#Area(μm2) 153.6±75.7 368.8±73.0* 168.3±50.0# 187.6±36.9#

2 CaMKⅡδ可變剪接的改變

兩腎一夾術(shù)后8周，2K1C組大鼠心肌CaMKⅡδ可變剪接表現(xiàn)為A、B亞型mRNA表達(dá)與假手術(shù)組相比升高，分別為假手術(shù)組的2倍和2.5倍(P＜0.05)，CaMKⅡδC亞型mRNA表達(dá)顯著下降，為假手術(shù)組的53%(P＜0.05);與2K1C組相比，EGCG組CaMKⅡδA、B亞型mRNA表達(dá)下降，分別為2K1C組的48%和43%(P＜0.05)，CaMKⅡδC亞型 mRNA表達(dá)升高，為2K1C組的1.7倍(P＜0.05);哈爾堿組大鼠與2K1C組相比，CaMKⅡδA、B亞型mRNA表達(dá)下降，分別為2K1C組的51%和45%(P＜0.05)，CaMKⅡδC亞型mRNA表達(dá)升高，為2K1C組的1.8倍(P＜0.05);與假手術(shù)組相比，EGCG和哈爾堿組CaMKⅡδA、B、C 3種亞型mRNA表達(dá)均無顯著差異(P ＞0.05)，見圖2、表2。

Figure 2.Changes of CaMK II δA，B and C mRNA expression in the myocardium of rats.M:marker;1，2:sham;3，4:2K1C;5，6:EGCG;7，8:harmine.圖2 大鼠心肌CaMK II δA、B、C亞型mRNA表達(dá)變化

表2 不同組別大鼠CaMK II δA、B、C亞型mRNA表達(dá)的比較Table 2.The comparison of CaMK II δA，B，C mRNA expression in different groups(±s.n=8)

表2 不同組別大鼠CaMK II δA、B、C亞型mRNA表達(dá)的比較Table 2.The comparison of CaMK II δA，B，C mRNA expression in different groups(±s.n=8)

*P＜0.05 vs sham group;#P＜0.05 vs 2K1C group.

Group CaMK II δA CaMK II δB CaMK II δC Sham 0.051 ±0.014 0.174 ±0.028 0.143 ±0.019 2K1C 0.106 ±0.011* 0.447 ±0.050* 0.076 ±0.009*EGCG 0.051 ±0.007# 0.194 ±0.023# 0.131 ±0.012#Harmine 0.054 ±0.008# 0.203 ±0.022# 0.136 ±0.025#

3 大鼠心肌Dyrk1A蛋白質(zhì)表達(dá)的變化

大鼠心肌Dyrk1A蛋白質(zhì)表達(dá)以Dyrk1A蛋白與GAPDH蛋白條帶的吸光度比值表示。2K1C組大鼠左室心肌Dyrk1A蛋白表達(dá)為1.651±0.282，較假手術(shù)組(0.585±0.108)升高1.8倍(P＜0.05);EGCG組Dyrk1A蛋白表達(dá)為0.828±0.147，較2K1C組下降50%(P＜0.05);哈爾堿組Dyrk1A蛋白表達(dá)為0.909±0.099，較2K1C組顯著下降，為2K1C組的55%(P ＜0.05)，見圖3。

Figure 3.The changes of Dyrk1A protein expression in the myocardium of rats.±s.n=8.*P＜0.05 vs sham group;#P ＜0.05 vs 2K1C group.圖3 大鼠心肌Dyrk1A蛋白質(zhì)表達(dá)的變化

4 大鼠心肌ASF蛋白質(zhì)表達(dá)的變化

大鼠心肌ASF蛋白質(zhì)表達(dá)以ASF蛋白與GAPDH蛋白條帶的吸光度比值表示。2K1C組大鼠左室心肌ASF蛋白表達(dá)為0.150±0.022，較假手術(shù)組下降，表達(dá)量是假手術(shù)組 ASF蛋白表達(dá)(0.310±0.023)的48%(P＜0.05);EGCG組為0.304±0.041，較2K1C顯著升高，表達(dá)量為2K1C組的2.0倍;哈爾堿組 ASF蛋白表達(dá)為 0.318±0.036，為2K1C組的2.1倍(P＜0.05)，見圖4。

討 論

本實(shí)驗(yàn)利用兩腎一夾的大鼠模型發(fā)現(xiàn):術(shù)后8周，2K1C組大鼠收縮壓、舒張壓、LVW、LVW/BW和心肌細(xì)胞面積較假手術(shù)組顯著升高，提示模型制備成功，大鼠血壓升高并發(fā)生了心肌肥厚。實(shí)驗(yàn)同時(shí)發(fā)現(xiàn)在肥厚心肌中存在CaMKⅡδ的可變剪接調(diào)控紊亂，表現(xiàn)為CaMKⅡδA、B亞型mRNA表達(dá)升高，CaMKⅡδC亞型mRNA表達(dá)下調(diào);Dryk1A抑制劑EGCG、哈爾堿在預(yù)防心肌肥厚同時(shí)，可改善CaMKⅡδ的可變剪接調(diào)控紊亂，表現(xiàn)為下調(diào)CaMKⅡδA、B亞型mRNA表達(dá)，并使CaMKⅡδC亞型mRNA表達(dá)升高。上述結(jié)果提示CaMKⅡδ的可變剪接調(diào)控紊亂參與了腎血管性高血壓大鼠的心肌肥厚過程，也證實(shí) CaMKⅡδ 是介導(dǎo)心肌肥厚的重要激酶［2，6－9］。

Figure 4.The changes of ASF protein expression in the myocardium of rats.±s.n=8.*P＜0.05 vs sham group;#P ＜0.05 vs 2K1C group.圖4 大鼠心肌ASF蛋白質(zhì)表達(dá)的變化

ASF是一種富含精氨酸和絲氨酸的剪接體，參與多種前體mRNA分子的可變剪接［10］。在ASF基因心臟靶向敲除的小鼠中發(fā)現(xiàn)，CaMKⅡδ的剪接產(chǎn)物發(fā)生了變化，CaMKⅡδB表達(dá)增加，而CaMKⅡδC的表達(dá)下降，引起心臟心肌興奮偶聯(lián)機(jī)制失調(diào)，心肌肥厚，進(jìn)而引起擴(kuò)張性心肌病和心力衰竭［4］，提示ASF參與了CaMKⅡδ的可變剪接。前期我們利用已構(gòu)建的CaMKⅡδ minigene和ASF共轉(zhuǎn)染COS－7或H293T細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)ASF可促進(jìn) CaMKⅡδC表達(dá)，而δA和δB表達(dá)均下降，也證實(shí)了ASF對CaMKⅡδ可變剪接的調(diào)控作用［11］。ASF是受磷酸化高度調(diào)控的蛋白，不同的磷酸化水平可影響其細(xì)胞內(nèi)定位和功能。Dyrk1A是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，位于人類21號染色體的關(guān)鍵區(qū)域［12］。本課題組最近的研究顯示Dyrk1A可磷酸化ASF，促進(jìn)它轉(zhuǎn)位到無活性絲氨酸/精氨酸豐富蛋白存儲(chǔ)部位——核斑，從而抑制ASF結(jié)合到新生轉(zhuǎn)錄體，失去對可變剪接基因的調(diào)節(jié)作用［5］，提示存在Dyrk1A經(jīng) ASF調(diào)控 CaMKⅡδ可變剪接的信號通路。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):與假手術(shù)組相比，2K1C組大鼠在心肌發(fā)生肥厚時(shí)，心肌中Dyrk1A蛋白表達(dá)上調(diào)，ASF蛋白表達(dá)下降(胞漿 ASF蛋白表達(dá)下調(diào)考慮與Dyrk1A致ASF磷酸化后移位至核斑有關(guān))，同時(shí)心肌中CaMKⅡδ可變剪接調(diào)控紊亂。哈爾堿是目前發(fā)現(xiàn)的最具特異性和高效的Dyrk1A抑制劑［12－13］，兩腎一夾大鼠在給予哈爾堿干預(yù)后，大鼠LVW、LVW/BW及心肌細(xì)胞面積顯著下降，心肌肥厚程度減輕，同時(shí)心肌中存在Dyrk1A蛋白表達(dá)下降，胞漿ASF蛋白表達(dá)上調(diào)和CaMKⅡδ可變剪接調(diào)控改善，提示Dyrk1A經(jīng)ASF調(diào)控CaMKⅡδ可變剪接調(diào)控的信號通路參與了腎血管性高血壓大鼠心肌肥厚的過程。

EGCG提取自綠茶，是茶多酚生物活性的主要成份，近年研究認(rèn)為EGCG是特異且安全的Dyrk1A抑制劑，可以保護(hù)由于Dyrk1A過表達(dá)引起的腦損傷［14］和減輕腹主動(dòng)脈縮窄所致的大鼠心肌肥厚，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)EGCG抑制心肌肥厚的機(jī)制部分與調(diào)節(jié)絲裂素活化蛋白激酶信號通路相關(guān)［15］。本實(shí)驗(yàn)中，EGCG組大鼠LVW、LVW/BW及心肌細(xì)胞面積均顯著低于2K1C組，提示EGCG可預(yù)防腎血管性高血壓大鼠心肌肥厚;EGCG在抑制心肌肥厚同時(shí)，大鼠心肌中Dyrk1A表達(dá)上調(diào)、胞漿ASF蛋白質(zhì)表達(dá)下降及CaMKⅡδ可變剪接調(diào)控改善，提示EGCG抑制腎血管性高血壓大鼠心肌肥厚與其對心肌中Dyrk1A－ASF－CaMKⅡδ可變剪接信號通路的抑制有關(guān)。

［1］ Colomer JM，Mao L，Rockman HA，et al.Pressure overload selectively up－regulates Ca2+/calmodulin－dependent protein kinase II in vivo［J］.Mol Endocrinol，2003，17(2):183－192.

［2］ Maier LS.Role of CaMKII for signaling and regulation in the heart［J］.Front Biosci，2009，14:486－496.

［3］ Braun AP，Schulman H.The multifunctional calcium/calmodulin－dependent protein kinase:from form to function［J］.Annu Rev Physiol，1995，57(3):417－445.

［4］ Xu X，Yang D，Ding JH，et al.ASF/SF2－regulated CaMKIIdelta alternative splicing temporally reprograms excitation－contraction coupling in cardiac muscle［J］.Cell，2005，120(1):59－72.

［5］ Shi J，Zhang T，Zhou C，et al.Increased dosage of Dyrk1A alters alternative splicing factor(ASF)－regulated alternative splicing of tau in Down syndrome［J］.J Biol Chem，2008，283(42):28660－28669.

［6］ Backs J，Backs T，Neef S，et al.The delta isoform of CaM kinase II is required for pathological cardiac hypertrophy and remodeling after pressure overload［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2009，106(7):2342－2347.

［7］ Mishra S，Ling H，Grimm M，et al.Cardiac hypertrophy and heart failure development through Gq and CaM kinase II signaling［J］.J Cardiovasc Pharmacol，2010，56(6):598－603.

［8］ Li C，Cai X，Sun H，et al.The δA isoform of calmodulin kinase II mediates pathological cardiac hypertrophy by interfering with the HDAC4－MEF2 signaling pathway［J］.Biochem Biophys Res Commun，2011，409(1):125－130.

［9］ 李 超，劉善紅，張家明，等.長期甲狀腺素刺激對大鼠心肌Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ的影響［J］.中國病理生理雜志，2012，28(1):147－151.

［10］ Dreyfuss G，Kim VN，Kataoka N.Messenger－RNA－binding proteins and the messages they carry［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2002，3(3):195－205.

［11］ Gu Q，Jin N，Sheng H，et al.Cyclic AMP－dependent protein kinase A regulates the alternative splicing of CaMKIIδ［J］.PLoS One，2012，6(11):e25745.

［12］ Becker W，Sippl W.Activation，regulation，and inhibition of DYRK1A［J］.FEBS J，2011，278(2):246－256.

［13］ Adayev T，Wegiel J，Hwang YW.Harmine is an ATP－competitive inhibitor for dual－specificity tyrosine phosphorylation－regulated kinase 1A(Dyrk1A)［J］.Arch Biochem Biophys，2011，507(2):212－218.

［14］ Guedj F，Sebrie C，Rivals I，et al.Green tea polyphenols rescue of brain defects induced by overexpression of DYRK1A［J］.PLoS One，2009，4(2):e4606.

［15］ Chen DD，Dong YG，Liu D，et al.Epigallocatechin－3－gallate attenuates cardiac hypertrophy in hypertensive rats in part by modulation of mitogen－activated protein kinase signals［J］.Clin Exp Pharmacol Physiol，2009，36(9):925－932.