熊膽降熱丸中兒茶素在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究

季 平，袁浩宇，林 勇，易 紅，王 鵬

(核工業(yè)四一六醫(yī)院，四川 成都 610051)

熊膽降熱丸是由熊膽、兒茶、大黃等七味中藥組方的復(fù)方制劑，具有清熱、解毒、通便等功效。兒茶素(catechin)為兒茶的主要成分，別名兒茶酸，為黃烷衍生物，具有防治心血管疾病、預(yù)防癌癥等多種功能[1－5]。目前，國內(nèi)外對(duì)兒茶素類化合物的體內(nèi)研究多集中在兒茶素體內(nèi)代謝方面，也有少量關(guān)于兒茶素單體、表兒茶素單體或兒茶素脂質(zhì)體經(jīng)口服或靜脈注射給藥后在家兔、大鼠體內(nèi)代謝研究的報(bào)道[6－9]，尚無兒茶中藥復(fù)方制劑中的兒茶素體內(nèi)代謝研究的報(bào)道。筆者對(duì)大鼠口服熊膽降熱丸后兒茶素的藥代動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了研究，為含兒茶中藥復(fù)方制劑的體內(nèi)研究和臨床合理用藥提供參考。

1 儀器與試藥

LC－10ATvp型高效液相色譜儀(日本島津);SPD－10Avp型紫外檢測器;BS224S萬分之一電子天平(德國賽多利斯);pHS－3C型酸度計(jì)(成都方舟科技開發(fā)公司);LD4－2型臺(tái)式離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠);YHK－Ⅱ型液體快速混合器(江西醫(yī)療器械廠)。熊膽降熱丸(四川大學(xué)藥學(xué)院藥劑教研室，規(guī)格為0.1 g，批號(hào)為061001)，兒茶素對(duì)照品(中國藥品生物制品檢定所，供含量測定用，批號(hào)為110877－200602);乙腈為色譜純(美國Fisher公司)，水為重蒸水，其余試劑均為分析純。健康SD大鼠，體重250～300g，由四川大學(xué)華西動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證為SCXK(川I)10－2006。試驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Hypersil C18柱(250mm×4.6mm，10μm);流動(dòng)相:乙腈－水－三乙胺(6 ∶94 ∶0.3，磷酸調(diào)節(jié) pH=(4.0 ±0.1);檢測波長:205 nm;柱溫:40℃;流速:1mL/min。

2.2 溶液制備

精密稱取兒茶素對(duì)照品適量，用甲醇溶解成含兒茶素240mg/L的對(duì)照品貯備液，于冰箱－20℃貯存，4周內(nèi)使用，臨用前用甲醇稀釋至所需濃度。取熊膽降熱丸10粒，研細(xì)，稱取細(xì)粉約0.3 g，置圓底燒瓶中，加水25mL浸泡24 h后于80℃水浴加熱1 h，過濾，取濾液，測定出提取液中兒茶素的濃度，作為熊膽降熱丸供試品溶液。

2.3 血樣處理方法

取血漿樣品 100μL，甲醇 －飽和硫酸鋅(1∶1)200μL，漩渦混合1min，以10 000 r/min的速度離心5min，精密量取上清液50μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖和峰面積，以外標(biāo)法將測量值帶入隨行工作曲線，計(jì)算血漿中兒茶素的濃度。

2.4 方法學(xué)考察

專屬性考察:空白血漿、空白血漿加對(duì)照品、用藥后血漿樣品色譜圖見圖1。結(jié)果兒茶素在23.0 min左右出峰，峰形良好，血漿中內(nèi)源性成分對(duì)測定無干擾。

圖1 高效液相色譜圖

標(biāo)準(zhǔn)曲線制備:于100μL空白大鼠血漿中，加入不同濃度兒茶素對(duì)照品溶液 20μL，制成含兒茶素質(zhì)量濃度依次為 0.12，0.24，0.48，1.2，2.4，4.8，9.6 mg/L 的溶液，照擬訂方法記錄色譜圖。以峰面積(A)為縱坐標(biāo)、兒茶素質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 A=9.561 ×103C+83.6，(r=0.999 2)，定量限為 0.12 mg/L。結(jié)果表明，兒茶素在 0.12 ～ 9.6mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，與峰面積線性關(guān)系良好。

回收率和精密度試驗(yàn):以空白血漿配制低、中、高(0.24、1.2和4.8mg/L)3個(gè)質(zhì)量濃度的兒茶素標(biāo)準(zhǔn)系列各5份，按2.3項(xiàng)下方法操作，計(jì)算日內(nèi)、日間變異系數(shù)，評(píng)價(jià)方法的精密度和準(zhǔn)確度;以流動(dòng)相代替空白血漿，制備低、中、高 (0.24，1.2，4.8 mg/L)3個(gè)質(zhì)量濃度的兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按2.3項(xiàng)下方法操作，以血漿樣本與純品中兒茶素的峰面積比值計(jì)算提取回收率。結(jié)果低、中、高(0.24、1.2 和 4.8mg/L)3 個(gè)濃度的血漿樣品的日內(nèi)及日間變異均低于15%，回收率為90.2% ～97.1%。見表1。

穩(wěn)定性試驗(yàn):配制低、中、高(0.24，1.2，4.8mg/L)3 個(gè)質(zhì)量濃度血漿樣品各3份;取1份，按2.3項(xiàng)下方法操作，分別于室溫下放置0，2，4，6 h后測定，考察樣品處理后在室溫條件下的穩(wěn)定性;1份放置于－20℃ 冰箱中，反復(fù)凍融3次，考察反復(fù)凍融對(duì)藥物的影響;另1份在－20℃冰箱冷凍30 d后，考察藥物在冷凍時(shí)放置的穩(wěn)定性。結(jié)果測定值的 RSD均小于10%，表明血漿樣品室溫下放置6 h、反復(fù)凍融和－20℃冰箱中冷凍保存30 d后穩(wěn)定性均良好。

表1 精密度、準(zhǔn)確度和提取回收率結(jié)果(n=5)

2.5 動(dòng)物試驗(yàn)

取8只大鼠，雌雄各半，在試驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。試驗(yàn)前12 h禁食，全程不禁飲;灌胃給予熊膽降熱丸供試液，于給藥前及給藥后 0.25，0.5，0.75，1，1.5，2，4，6，10，12，24 h 尾靜脈斷尾取血，分取血漿，置－20℃冰箱中保存待測。血藥濃度－時(shí)間曲線見圖2。用DAS2.0藥代動(dòng)力學(xué)計(jì)算程序進(jìn)行處理，計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。結(jié)果兒茶素在大鼠體內(nèi)過程符合二室模型，藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表2。

圖2 兒茶素均值血藥濃度－時(shí)間曲線(n=8)

表2 兒茶素口服給藥后的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)(n=8)

3 討論

大鼠單劑量口服熊膽降熱丸提取液(相當(dāng)于兒茶素50mg/kg)后，兒茶素在體內(nèi)的處置符合二室模型，約0.5 h達(dá)峰，吸收迅速;消除半衰期較慢，為(7.779±4.568)h;中心室分布容積為(19.635 ±8.632)L/kg，遠(yuǎn)大于大鼠的體液總體積，說明分布廣泛。

對(duì)兒茶素對(duì)照品溶液(10μg/mL)進(jìn)行紫外掃描(200～400nm)。結(jié)果兒茶素在280 nm波長處有吸收峰，在205 nm波長處有較強(qiáng)的末端吸收，其吸收強(qiáng)度約為前一波長處的2倍。故為提高體內(nèi)分析的靈敏度，選擇205 nm為兒茶素血藥濃度的測定波長。

兒茶素母核上的氧原子和酚羥基與十八烷基硅烷鍵合硅膠上的殘余硅醇基可形成氫鍵，使色譜峰拖尾，加入三乙胺使峰的對(duì)稱性得到改善，三乙胺濃度為0.3%時(shí)最佳。在確定蛋白質(zhì)沉淀劑時(shí)，筆者考察了3種蛋白沉淀劑:甲醇、乙腈、甲醇－飽和硫酸鋅溶液(1∶1)，使用甲醇－飽和硫酸鋅(1∶1)時(shí)，兒茶素的藥物釋出率最高，可能是因?yàn)楫?dāng)溶液pH＞p I時(shí)，蛋白質(zhì)易與重金屬離子結(jié)合成不溶性的蛋白鹽而沉淀。

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