尼莫地平對兔早期脊髓缺血再灌注損傷的保護作用

張國臣 吳新建 郭少雷 張弩 張恒 齊鐵偉

脊髓缺血再灌注損傷(spinal cord ischemicreperfusion injury，SCII)是指所有導(dǎo)致脊髓缺血性損傷的因素去除后，脊髓恢復(fù)血供，神經(jīng)功能障礙沒有得到應(yīng)有的改善，反而在原缺血性損傷的基礎(chǔ)上進一步加重，甚至在病理上出現(xiàn)不可逆性脊髓神經(jīng)元遲發(fā)性死亡的現(xiàn)象[1-2]，屬于原發(fā)性脊髓損傷的繼發(fā)性損害。臨床上常見于脊髓內(nèi)顯微外科手術(shù)、各種類型脊髓損傷、胸腹主動脈手術(shù)等。國內(nèi)外文獻報道尼莫地平對SCII是否有保護作用仍有異議[3-6]，而我們在臨床工作中發(fā)現(xiàn)尼莫地平對SCII有一定治療效果，故設(shè)計本實驗探討尼莫地平對SCII的作用。

1 材料與方法

1.1 研究對象 成年新西蘭大白兔18只，雌雄不限，體質(zhì)量(2.5±0.5)kg，購于廣東省實驗動物中心。尼莫地平注射液購自德國拜耳公司。

1.2 SCII模型的建立及分組 參照文獻建立缺血再灌注模型[7-9]：實驗動物術(shù)前禁食約12 h。速眠新Ⅱ(0.2 mL／kg)肌肉注射加3%戊巴比妥(1 mL／kg)靜脈注射復(fù)合麻醉。然后將兔全身肝素化(200 U／kg)，取腹部正中偏左約1.5 cm縱向手術(shù)切口開腹，充分顯露腹主動脈，游離左側(cè)腎動脈至雙側(cè)髂總動脈分叉處之腹主動脈，輕輕翻轉(zhuǎn)腹主動脈，辨認腹主動脈背側(cè)發(fā)出的腰動脈。自上向下分別為下 L1、下 L2、下 L3、下 L4、下 L5 動脈[9]，取四個動脈瘤夾分別夾閉下L1、下L2、下L3、下 L4動脈后計時，90 min后逐一取下動脈瘤夾使腰動脈再灌注，逐層關(guān)腹。研究對象隨機分為3組：假手術(shù)組、對照組、尼莫地平組，每組6只，置于相同環(huán)境飼養(yǎng)，每籠1只。其中尼莫地平組：開腹后行目標腰動脈夾閉90 min，術(shù)后1 h開始靜脈注射尼莫地平注射液0.17 mg／(kg·次)+生理鹽水(稀釋為 10 mL，每 8 h一次，每次注射 15 min)；假手術(shù)組：開腹后行目標腰動脈暴露90 min，術(shù)后1h同方法同頻率注射同體積生理鹽水；對照組：開腹后行目標腰動脈夾閉90 min，術(shù)后1h同方法同頻率注射同體積生理鹽水。

1.3 Reuter 評 分 Reuter 感覺運動評分[10]標準：①牽張反射(0正常，1輕微反射亢進或減弱，2反射亢進或消失)；②疼痛回縮反射(0靈活的，1緩慢笨拙的，2消失)；③背部感覺(0完全正常，1部分正常，2消失的)；④肌張力(0正常，1張力減退或亢進，2張力消失或痙攣狀態(tài))；⑤后肢運動能力(0可行走，1僅能站立，2可自由活動后肢，3不能活動后肢)。每8 h靜脈注射藥物前評定一次，每次各研究對象評定2 min。各組各個時間點的Reuter評分為5項評分的總和。

1.4 動物標本摘取、染色及觀察 3 d后速眠新Ⅱ加3%戊巴比妥復(fù)合麻醉，仰臥位固定，開胸暴露心臟，經(jīng)主動脈弓先后灌注磷酸鹽緩沖液和40 g／L 的多聚甲醛各 1000～1500 mL[7]，再將兔俯臥位固定，背部正中切開，分離椎旁肌肉，剪除L4～L7棘突和椎板，暴露硬脊膜，縱向切開，截取腰段脊髓組織(L5～L7)放入10%福爾馬林溶液內(nèi)固定2～5 d。所取標本均行常規(guī)蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)、甲苯胺藍尼氏染色法(tolridine blue Nissl staining)和免疫組織化學(xué)染色鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)(streptavidin-perosidase，SP)法。染色成功后按照Rexed脊髓灰質(zhì)分區(qū)標準[11]取脊髓前角視野(8～9區(qū))觀察，比較三組之間脊髓灰質(zhì)前角整體細胞結(jié)構(gòu)、正常尼氏小體數(shù)量、免疫組化表達程度等。染色指數(shù)(staining index，SI)作為免疫組化半定量評價指標，SI＝染色區(qū)域比例×染色強度，染色區(qū)域比例計分：根據(jù)染色區(qū)域占觀察區(qū)域的百分率分為四級，1級(≤25%)、2級(＞25%，≤50%)、3 級(＞50%，≤75%)、4 級(＞75%)，分別記1～4分。染色強度計分：按染色深淺分四級，1級(無染色)、2 級(弱陽性，呈淺黃色)、3 級(中等陽性，呈棕黃色)、4級(強陽性，呈棕色)，分別記 1～4分。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用 SPSS 19.0處理數(shù)據(jù)。Reuter評分資料、尼氏小體計數(shù)資料和染色指數(shù)資料用[M(QL，QU)]表示，采用 Wilcoxon 秩和檢驗兩兩比較并用Bonferroni法調(diào)整檢驗水準為α′α＝ 0.05，α′＝ 0.05／3 ＝ 0.017。

2 結(jié)果

2.1 Reuter感覺運動評分 表1顯示假手術(shù)組和對照組、假手術(shù)組和尼莫地平組之間有明顯差異；對照組和尼莫地平組之間在第1 d、第2 d時差異無明顯統(tǒng)計學(xué)意義(T1d＝36.00，P1d＝0.61＞0.017；T2d＝33.50，P2d＝0.29＞0.017)。 而在第 3 d時差異有明顯統(tǒng)計學(xué)意義(T3d＝25.00，P3d＝0.01＜0.017)。

表1 Reuter感覺運動功能評分M(QL，QU)

2.2 脊髓組織病理學(xué)觀察 HE染色可見假手術(shù)組脊髓灰質(zhì)前角整體結(jié)構(gòu)清晰、完整，可見較大的輪廓清晰、結(jié)構(gòu)正常的運動神經(jīng)元，未見明顯炎癥細胞浸潤、出血、水腫、空泡樣變化等異常(圖1A)；對照組脊髓灰質(zhì)前角結(jié)構(gòu)紊亂，可見局部中重度水腫、空泡樣變，神經(jīng)元及膠質(zhì)細胞損傷較重，未見結(jié)構(gòu)明顯的正常運動神經(jīng)元(圖1B)；尼莫地平組脊髓灰質(zhì)前角結(jié)構(gòu)紊亂較對照組輕，局部輕中度水腫、空泡樣變，可見明顯紅色神經(jīng)元的存在(圖 1C)。

尼氏染色可見假手術(shù)組脊髓灰質(zhì)前角內(nèi)尼氏小體結(jié)構(gòu)清楚，胞漿內(nèi)所見嗜堿性顆粒分布均勻，數(shù)量較多(圖2A)；對照組未見正常尼氏小體結(jié)構(gòu)，僅見少量中央性尼氏小體溶解后殘留的嗜堿性顆粒(圖2B)；尼莫地平組可見少量正常結(jié)構(gòu)尼氏小體，且可見胞質(zhì)中央尼氏小體溶解尚未消失的嗜堿性顆粒聚集(圖2C)。各組尼氏小體計數(shù)結(jié)果見表2，三組之間，兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(T＝21.00，P＜0.017)。

神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白的表達，假手術(shù)組未見脊髓前角明顯條索狀、棕黃色顆粒表達(圖3A)；對照組見大量條索狀、棕色顆粒樣GFAP表達，表達面積較廣，染色較重(圖3B)；尼莫地平組亦可見類似的棕黃色顆粒，但較對照組表達面積小，染色程度較輕(圖3C)。各組染色指數(shù)結(jié)果見表3，三組之間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(T＝21.00，P ＝ 0.002 ＜ 0.017)。

圖1 脊髓灰質(zhì)前角HE染色(×200)。

圖2 脊髓灰質(zhì)前角尼氏染色(×200)。

表2 脊髓灰質(zhì)前角尼氏小體計數(shù)

圖3 脊髓灰質(zhì)前角GFAP染色(×200)。

表3 脊髓灰質(zhì)前角GFAP染色指數(shù)

3 討論

本實驗研究對象脊髓供血動脈比較單一，且相互間缺少充分的吻合支，尤其是腰段脊髓，以腰動脈供血為主，為夾閉腰動脈建立模型提供了理論基礎(chǔ)。研究對象體積較大，血管易于分離，可單純夾閉腰動脈，能避免夾閉腹主動脈后雙下肢缺血對實驗結(jié)果的影響，使誤差更小。模型建立后行為學(xué)和病理學(xué)方面的差異較為穩(wěn)定，提示模型建立成功，所選研究對象滿足實驗條件。

SCII是一個復(fù)雜的、多種因素共同參與的病理生理學(xué)過程，其中細胞內(nèi)Ca2+超載是引起神經(jīng)損傷的重要一環(huán)，理論上抑制Ca2+內(nèi)流可減輕神經(jīng)損傷程度。尼莫地平是經(jīng)典的第二代鈣離子通道阻滯劑之一，可作用于與鈣離子通道有關(guān)的血管受體[12]和神經(jīng)元受體[13]，明顯降低細胞內(nèi)鈣離子水平，達到抗血管痙攣和抗缺血作用，提高神經(jīng)元的缺血耐受能力和功能的穩(wěn)定性。

本實驗中，從表1可以看出，各觀察時間點假手術(shù)組和對照組、假手術(shù)組和尼莫地平組之間差異明顯。3 d時尼莫地平組Reuter評分較對照組低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，1 d、2 d時兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，我們考慮原因為SCII最初階段再灌注損傷尚未達到一定程度，而隨著再灌注損傷的加重，尼莫地平對脊髓的保護作用才得以體現(xiàn)。圖1表明在治療3 d后，尼莫地平組脊髓灰質(zhì)前角的整體結(jié)構(gòu)紊亂、水腫、空泡樣變等損傷較對照組輕，且可見大量紅色神經(jīng)元。紅色神經(jīng)元是神經(jīng)元損傷后處于早期階段的一種標志。因此，我們認為尼莫地平可能通過延緩SCII帶來的一系列序貫性損傷，使損傷維持在較早階段甚至可逆階段。圖2表明，尼莫地平組尼氏小體數(shù)量、結(jié)構(gòu)均較對照組好轉(zhuǎn)，這是因為表示運動神經(jīng)元功能活性的尼氏小體在發(fā)生中央性尼氏小體溶解的早期，病變過程是可逆的，具有代償意義，而給予的適當?shù)哪崮仄礁深A(yù)措施使得部分損傷早期的尼氏小體基本恢復(fù)正常。尼氏小體計數(shù)之間的差異也表明治療有效(表2)。 星形膠質(zhì)細胞(astrocyte，Ast)在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理生理過程及神經(jīng)瘢痕修復(fù)中起重要作用。作為公認的Ast的特征性標記蛋白[14]，神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP)的表達能反映出神經(jīng)細胞損傷程度，且兩者呈反比關(guān)系，即神經(jīng)細胞損傷越重，GFAP表達量越多。如圖3所示，假手術(shù)組擬定區(qū)域未見明顯GFAP表達，脊髓無明顯損傷；尼莫地平組和對照組均見明顯GFAP表達，且尼莫地平組表達產(chǎn)物面積及染色程度較對照組低，間接證明尼莫地平組脊髓損傷較對照組輕，說明尼莫地平的治療減輕了脊髓損傷程度。

總之，通過本研究發(fā)現(xiàn)，尼莫地平作為經(jīng)典的鈣離子通道阻滯劑，可以在神經(jīng)行為學(xué)和組織病理學(xué)方面有效地降低脊髓缺血再灌注所帶來的一系列序貫性損傷，有一定的保護作用，但其臨床療效仍需在嚴密設(shè)計下進行臨床研究予以證實。

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