骨橋蛋白基因?qū)Υ竽c癌細(xì)胞增殖、侵襲及Akt磷酸化的影響

毛鎮(zhèn)偉 朱 靈 范 鈺

江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院腫瘤研究所，江蘇鎮(zhèn)江 212002

大腸癌（包括結(jié)腸癌和直腸癌）近年來在我國發(fā)病率逐年增高。由于診療技術(shù)限制級(jí)人群忽視，很多患者發(fā)現(xiàn)時(shí)即有轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移的方式主要有血行轉(zhuǎn)移、浸潤種植、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等，主要轉(zhuǎn)移至肝臟、淋巴結(jié)、肺部、腦部、及骨等部位。如何從分子水平進(jìn)行大腸癌轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究，可為干預(yù)阻斷大腸癌轉(zhuǎn)移提供一定的理論基礎(chǔ)。近年發(fā)現(xiàn)，骨橋蛋白（osteopontinin，OPN）與許多惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系具有重要的相關(guān)性[1-2]。但是目前尚不完全清楚該基因在人大腸癌細(xì)胞侵襲過程中的機(jī)制。2012年1月～2012年6月，本課題組借助于 RNA 干擾（RNA interference，RNAi）技術(shù)，以大腸癌Colo205 細(xì)胞為模型，對(duì)其采用OPN基因小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）轉(zhuǎn)染處理，探討了對(duì)癌細(xì)胞生長和侵襲的作用，并從信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路（Akt）方面探討了分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

人大腸癌細(xì)胞Colo 205 購自美國ATCC公司，本院組織細(xì)胞生物庫凍存。OPN基因siRNA的正義鏈序列：GAA ACU CCC UGU AAA CUA A dTdT；反義鏈序列：UAA GUU UAC AGG GAG UUU C dTdT，由美國Dharmacon公司合成。Akt及磷酸化抗體購自美國Santa Cruz公司。其他RNA提前試劑（Trizol，RNase 抑制劑），和逆轉(zhuǎn)錄試劑（SSRTⅡ、Taq 酶）及轉(zhuǎn)染試劑Oligofectamine購自美國Invitrogen公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染處理

人大腸癌Colo 205 細(xì)胞在含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液，37℃、5%CO2、 飽和濕度環(huán)境的條件下連續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前1 天，將濃度為1.0 ×105/mL的細(xì)胞接種于24 孔培養(yǎng)板24 h后，待細(xì)胞長滿60%～70%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。細(xì)胞分組：①空白對(duì)照組（Con-A）：未經(jīng)任何處理的大腸癌細(xì)胞；②脂質(zhì)體對(duì)照組（Con-B）；③錯(cuò)配siRNA體對(duì)照組（Con-C）；④不同濃度的siRNA組：10%胎牛血清的RPMI-1640 中含不同濃度 （6.25、12.5、25.0 nmol/L）的已用脂質(zhì)體包埋的siRNA。轉(zhuǎn)染后于不同時(shí)間采用胰酶消化收取細(xì)胞，進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3 OPN基因mRNA水平檢測(cè)

根據(jù)文獻(xiàn)[3]，采用熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)OPN基因mRNA水平。

1.3.1 RNA抽提 應(yīng)用Trizol抽提細(xì)胞總RNA。棄盡培養(yǎng)液，加入0.5mL的Trizol試劑，反復(fù)吹打，轉(zhuǎn)移到1.5mL的eppendorf管中，加入0.2 mL的氯仿，振蕩混勻15s，室溫放置5min后,4℃條件下15000 g離心15min，吸取上清置另一新的eppendorf管中，加入0.5mL Trizol試劑體積的異丙醇，混勻后室溫放置10 min，4℃條件下15000 g離心10 min，棄上清，沉淀加75%乙醇，7 500 g離心5min洗滌1次，室溫放置10 min左右，加入10 μL的0.1%DEPC水溶解，260 nm測(cè)光密度，用40 μg/mLOD計(jì)算RNA濃度，用0.1%DEPC水調(diào)節(jié)濃度至 200 ng/μL，備用。

1.3.2 逆轉(zhuǎn)錄 取 1 μg 總 RNA， 加 1 μL oligo-dT （15mer），70℃孵育10 min，然后迅速放在冰上冷卻2 min，加入以下試劑：5 ×1 st strand buffer 4 μL；0.1 mmol/L DTT 2 μL；10 mmol/L dNTP 1 μL；RNase inhibitor 1 μL；SSRTⅡ 0.5μL；H2O 0.5μL。42℃，孵育 52 min，然后 70℃ 15min。 加 80 μL 水稀釋。 然后進(jìn)行實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)。

1.3.3 熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR實(shí)時(shí)PCR具體方法參照ABI公司的標(biāo)準(zhǔn)程序來進(jìn)行。OPN引物序列為上游：5′-GGGACTTCTCAGGTCGTGTC-3′； 下 游 ：5′-AGCCCCGTACTTCTTCAGGT-3′。 FAM 探針：5'-CCGCTTCTCGTCGATGTAGGTCACG-3'-TAMRA。以3-磷酸甘油醛脫氫酶基因（GAPDH）為內(nèi)參。50 μL 反應(yīng)體系：OPN 基因上、下游引物各1.5μL，F(xiàn)AM 1 μL，GAPDH 探 針 2.5μL，2 ×PCR Mix Buffer 26 μL，cDNA 10 μL，H2O 7.5μL。 然后在進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)條件為，循環(huán)反應(yīng)條件：50℃ 2 min，1 個(gè)循環(huán)；95℃ 10 min，1 個(gè)循環(huán)；95℃ 15s，60℃ 1 min。 40 個(gè)循環(huán)。

1.3.4 熒光實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果分析 上述反應(yīng)完成后，采用△△Ct法，計(jì)算OPN基因相對(duì)于GAPDH的△Ct（△Ct=Ct GAPDH－Ct OPN），以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。

1.4 軟瓊脂集落形成試驗(yàn)

癌細(xì)胞錨著不依賴性增殖采用軟瓊脂集落形成試驗(yàn)檢測(cè)，具體試驗(yàn)方法根據(jù)文獻(xiàn)所述[5]試驗(yàn)進(jìn)行。

1.5 體外侵襲試驗(yàn)

采用Boyden小室模型方法檢測(cè)。具體方法參照文獻(xiàn)[6]所述方法進(jìn)行。隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)視野內(nèi)的細(xì)胞數(shù)，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，每組計(jì)數(shù)3 份樣本。

1.6 癌細(xì)胞Akt磷酸化檢測(cè)

轉(zhuǎn)染48 h后，收集siRNA組和對(duì)照組癌細(xì)胞，以總Akt（Total-Akt）為內(nèi)參照，采用常規(guī)蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)各組癌細(xì)胞總 Akt及磷酸化 Akt（p-Akt）蛋白水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 11.5 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)OPN基因表達(dá)的影響

為下調(diào)OPN基因表達(dá)水平，本研究借助于RNA干擾技術(shù)，以siRNA轉(zhuǎn)染大腸癌Colo 205 細(xì)胞后，以熒光實(shí)時(shí)定量PCR方法跡檢測(cè)基因mRNA水平。結(jié)果顯示，與Con-A組細(xì)胞比較，不同濃度siRNA組mRNA明顯下調(diào)（圖1）。

圖1 OPN基因siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)大腸癌細(xì)胞OPN mRNA水平的影響

2.2 軟瓊脂集落形成試驗(yàn)

本研究采用軟瓊脂集落形成試驗(yàn)觀察癌細(xì)胞錨著不依賴性增殖情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞集落生長數(shù)明顯減少，且呈劑量依賴性（P＜0.05）。見圖2。

2.3 OPN siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)大腸癌細(xì)胞侵襲的影響

本研究Boyden 小室模型方法了解癌細(xì)胞侵襲力變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Con-A組集穿過濾膜胞數(shù)比較，不同濃度siRNA組穿膜的細(xì)胞數(shù)明顯減少（P＜0.05）。見圖3。

2.4 siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)大腸癌細(xì)胞Akt信號(hào)通路的影響

收集轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞，以蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)Akt磷酸化情況。如圖所示，與Con-A組比較，不同濃度siRNA組Akt磷酸化水平下降，且呈濃度依賴性。見圖4。

3 討論

由于RNAi及siRNA具有高效敲除基因表達(dá)的作用，已被許多學(xué)者用來研究基因功能和基因治療的重要工具之一。本研究針對(duì)OPN基因序列特點(diǎn)，設(shè)計(jì)合成siRNA，轉(zhuǎn)染處理大腸癌細(xì)胞后，采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞OPN mRNA被抑制。說明siRNA具有明顯下調(diào)OPNmRNA的效果，可以用于作為探討在大腸癌侵襲作用中的工具。

錨著依賴性（anchorage dependence）指的是細(xì)胞須黏附于特定的細(xì)胞外基質(zhì)上才能存活的特性和能力。正常真核細(xì)胞，除成熟血細(xì)胞外脫離基質(zhì)將會(huì)死亡，而絕大多數(shù)腫瘤細(xì)胞在脫離基質(zhì)時(shí)亦能存活，即可錨著不依賴性生長。檢測(cè)錨著不依賴性增殖一般參與軟瓊脂形成集落培養(yǎng)方法。癌細(xì)胞侵襲能力強(qiáng)，則在軟瓊脂上形成的集落數(shù)目多。本課題組發(fā)現(xiàn)，經(jīng)不同濃度的OPN siRNA轉(zhuǎn)染處理后，癌細(xì)胞軟瓊脂形成集落數(shù)明顯降低，且呈劑量依賴性。體外侵襲試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)OPN基因siRNA轉(zhuǎn)染處理后的大腸癌細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)顯著降低，且呈濃度依賴性。由此說明，下調(diào)OPN基因表達(dá)可明顯抑制大腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力。

癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移過程復(fù)雜，PI3K/Akt信號(hào)通路的激活引起了廣大研究學(xué)者的注意。Akt作為PI3K下游最重要的信號(hào)分子，由于和蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）和蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）高度同源，也稱為蛋白激酶B（PKB）。它是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，約由480 多個(gè)氨基酸序列構(gòu)成。目前發(fā)現(xiàn)的Akt家族成員有三種亞型：Aktl、Akt2和 Akt3，亦稱為 PKBa、PKBβ、PKBγ，分別由 3 個(gè)不同基因編碼[7]。Akt可被許多生長因子如血小板衍生生長因子、表皮生長因子和神經(jīng)生長因子激活[8]，激活的Akt可以Caspase-9 前體蛋白和Bad而使它們失活，從而起到保護(hù)細(xì)胞作用免于凋亡[9]。許多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，Akt信號(hào)通路激活，與癌細(xì)胞增殖及侵襲能力呈正相關(guān)[10-13]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，OPN基因siRNA轉(zhuǎn)染組Akt磷酸化水平明顯下調(diào)，且與濃度有關(guān)。

本研究提示，抑制大腸癌細(xì)胞Akt磷酸化水平，是OPN基因調(diào)控大腸癌細(xì)胞增殖、侵襲重要機(jī)制之一。

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