EF-hand對鈣調(diào)磷酸酶B同源蛋白2的生物學(xué)功能影響

張洪菊 李慶華 王立洪 藺亞妮 常國強(qiáng) 龐天翔

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院血液學(xué)研究所血液病醫(yī)院實(shí)驗(yàn)血液學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300020

鈣調(diào)磷酸酶B同源蛋白 （calcineurin B homologous protein，CHP）是具有多個 EF-hand 結(jié)構(gòu)的鈣離子（Ca2+）結(jié)合蛋白。目前報(bào)道該家族擁有3個成員，分別被命名為CHP1、CHP2、CHP3[1]。其中CHP1 廣泛表達(dá)于各種組織，CHP3 特異性表達(dá)在一些正常組織，而CHP2 與這兩個成員不同，它主要表達(dá)在一些腫瘤組織中[2]。最初因發(fā)現(xiàn)其在肝癌組織中高表達(dá)而命名為肝細(xì)胞癌抗原520（hepatocellular carcinoma antigen520，HCA520）[3]，因此被認(rèn)為是一種腫瘤相關(guān)抗原。CHP2 已被證明在腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移等方面具有重要作用[4]，目前的研究表明CHP2 主要是通過調(diào)節(jié)鈉氫離子交換蛋白 1（Na+/H+exchanger 1，NHE1）活性而發(fā)揮功能，通過與NHE1 結(jié)合而激活NHE1，發(fā)揮其調(diào)控細(xì)胞內(nèi)離子轉(zhuǎn)運(yùn)及細(xì)胞酸堿的功能[5-6]。但是，CHP2 作為一個Ca2+結(jié)合蛋白，EF-hand是其分子中結(jié)合Ca2+的關(guān)鍵序列，對CHP2 發(fā)揮正常功能具有重要作用，目前國內(nèi)尚缺乏EF-hand對CHP2 細(xì)胞內(nèi)定位、功能以及與NHE1的相互作用中的影響的報(bào)道，本研究將對這些內(nèi)容進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑及材料

45CaCl2購自美國Dupont-NEN公司。NHE表達(dá)缺陷的PS120 細(xì)胞系、CHP2 和NHE1的兔抗人多克隆抗體及野生型人NHE1的真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒pECE均由日本國立循環(huán)系統(tǒng)疾病中心研究所饋贈。E.Coli（BL21-star）、LipofectamineTM2000 Reagent kit購自美國Invitrogen公司。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國GIBCO公司。本實(shí)驗(yàn)中所用到的其他質(zhì)粒均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

PS120 及相應(yīng)的轉(zhuǎn)染子按常規(guī)方法在（含25mmol/L NaHCO3、體積分?jǐn)?shù)為10%的小牛血清、50 U/mL青霉素和50 μg/mL鏈霉素）DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)于37℃，含5%CO2，飽和濕度的培養(yǎng)箱中。

1.3 CHP2 cDNA的克隆及其表達(dá)載體的構(gòu)建

提取人類血液細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用PCR擴(kuò)增CHP2的全長cDNA序列，將其在合適的酶切位點(diǎn)克隆進(jìn)含有綠色熒光蛋白標(biāo)記基因的載體pEGFP-N1，對此重組質(zhì)粒命名為CHP2-GFP。同時采用基于PCR突變的方法，將四個EF-hand的-Z點(diǎn)的氨基酸替換為脂肪族的非極性氨基酸丙氨酸（Ala，A），這些突變EF-hand的重組質(zhì)粒分別命名為 CHP2-EF1m、CHP2-EF2m、CHP2-EF3m、CHP2-EF4m。

1.4 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染

應(yīng)用LipofectamineTM2000將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PS120細(xì)胞，轉(zhuǎn)染完成24 h后利用G418 篩選兩周，采用流式細(xì)胞儀，根據(jù)GFP熒光標(biāo)記分選得到含有相關(guān)重組質(zhì)粒的單克隆細(xì)胞株。

1.5 重組蛋白的制備

將CHP2 及其突變體的全長cDNA序列克隆到pET11（重組蛋白末端將帶有6個組氨酸的標(biāo)記）載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 E.Coli（BL21-star）制備重組蛋白 His tagged-CHP2。重組蛋白利用Ni+離子交換型樹脂分離純化重組蛋白。

1.6 SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳檢測CHP2 蛋白的表達(dá)及利用GFP熒光觀察蛋白定位

將分離純化后的重組CHP2 蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，利用考馬斯亮藍(lán)染色法，檢測純化的重組蛋白的分子量及其在聚丙烯酰胺凝膠上的泳動速度。

將共轉(zhuǎn)染由GFP標(biāo)記的CHP2 或其突變體重組質(zhì)粒及野生型人NHE1的真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒的PS120 細(xì)胞采用爬片法培養(yǎng)，待細(xì)胞長至合適密度后，采用4%多聚甲醛固定，制片，采用激光共聚焦顯微鏡觀察GFP熒光在細(xì)胞內(nèi)的分布。

1.7 Ca2+結(jié)合特征常數(shù)的測定

將分離純化得到的CHP2 及其突變體的重組蛋白與不同濃度的45Ca2+在25℃共同孵育60 min。孵育完成后將反應(yīng)的溶液體系經(jīng)過0.2 μm的濾膜過濾，以不含重組蛋白的反應(yīng)溶液體系作為陰性對照，待濾膜干燥后，采用放射性檢測儀計(jì)量45Ca2+的在膜上的殘留程度。以加入反應(yīng)體系的Ca2+含量為橫坐標(biāo)，以膜上殘留的45Ca2+為縱坐標(biāo)作圖，制作Ca2+平衡曲線。比較CHP2 野生型及不同的突變體45Ca2+結(jié)合特征常數(shù)的異同。

1.8 蛋白質(zhì)免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）

1.8.1 細(xì)胞裂解 收獲過表達(dá)NHE1的1 ×107PS120 細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗兩次，用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞置于1.5mL離心管里，加入1 mL IP細(xì)胞裂解液，之后4 000 r/min離心5min，吸取上清。

1.8.2 免疫沉淀 （IP）將上述的含蛋白提取物的上清液中加入30 μL的Protein G agarose，同時加入 4 μg特異抗體 （抗CHP2 或 NHE1），4℃輕微搖動 1 h，2 000 r/min 離心，棄上清，用預(yù)冷的IP細(xì)胞裂解液洗沉淀3次，加入2 ×蛋白上樣緩沖液，沸水煮3 min，吸上清。

1.8.3 電泳和轉(zhuǎn)膜 將所得到的上清上樣，先用SDS-PAGE電泳，再用半干法電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。再用另一種蛋白的抗體雜交，如果能得到特異的帶，而陰性對照（IgG）沒有帶，證明兩種蛋白相互結(jié)合。

1.8.4 蛋白免疫印記 （IB）分別在室溫下用含5%脫脂奶粉的TBST封閉1 h，一抗（抗NHE1 或CHP2）孵育1 h，二抗孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，每個樣本至少重復(fù)3次。

1.9 血清饑餓實(shí)驗(yàn)

相同數(shù)量的共表達(dá)NHE1/野生型CHP2（NHE1/CHP2）或NHE1/CHP2-EF3m/4m的PS120 細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，分別觀察在有血清或無血清培養(yǎng)條件下細(xì)胞狀態(tài)及數(shù)量變化。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 11.0 對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。45Ca2+結(jié)合平衡采用公式：45Ca2+=最大45Ca2+結(jié)合量/（1+Kd－[Ca2+]n）（Kd=Ca2+顯性解離常數(shù)，n=Hill系數(shù)）計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 EF-hand調(diào)節(jié)CHP2 蛋白的構(gòu)象

經(jīng)生物信息學(xué)方法分析表明CHP2 蛋白結(jié)構(gòu)內(nèi)含有4個可能的 EF-hand 結(jié)構(gòu)，分別命名為 EF1、EF2、EF3、EF4。 本研究分別成功構(gòu)建了CHP2 蛋白的4個EF-hand突變體CHP2-EF1m、CHP2-EF2m、CHP2-EF3m、CHP2-EF4m，突變點(diǎn)位于EF-hand的-Z點(diǎn)（圖1A）。將大腸桿菌產(chǎn)物表達(dá)純化后得到的CHP2 及其突變體蛋白采用SDS-PAGE檢測，發(fā)現(xiàn)已突變的CHP2-EF3m、CHP2-EF4m在凝膠上的電泳速度減慢，表明突變這兩個EF-hand可能使CHP2 蛋白構(gòu)象的發(fā)生改變（圖1B）。結(jié)果提示EF-hand3 和EF-hand4 對維持CHP2的正常構(gòu)象發(fā)揮重要的作用。

2.2 CHP2 結(jié)合Ca2+平衡曲線的測定

使用膜截留法測定了EF-hand突變對CHP2 鈣結(jié)合能力的影響。結(jié)果顯示突變EF-hand3 和EF-hand4 中任意一個，CHP2 結(jié)合鈣能力下降為正常的1/2；同時突變EF-hand3和EF-hand4，CHP2 不能結(jié)合Ca2+（圖2）。證實(shí) CHP2 作為一個鈣結(jié)合蛋白，其Ca2+離子的結(jié)合依賴于其分子結(jié)構(gòu)中的EF-hand3 和EF-hand4 模體結(jié)構(gòu)。

2.3 Ca2+影響CHP2 和NHE1 蛋白的相互結(jié)合

免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)表明，在Ca2+存在的條件下，NHE1 和CHP2 能夠得到很好的共沉淀，但當(dāng)利用螯合劑EDTA剝奪細(xì)胞內(nèi)的Ca2+之后，CHP2 和NHE1的相互結(jié)合減少，表明CHP2 結(jié)合Ca2+對其與NHE1的結(jié)合是至關(guān)重要的。見圖3。

2.4 EF-hand3 和EF-hand4 調(diào)節(jié)CHP2 在細(xì)胞膜上的定位

通過激光共聚焦顯微鏡觀察GFP標(biāo)記的蛋白定位，我量明顯較共表達(dá)NHE1/野生型CHP2 組減少，細(xì)胞死亡數(shù)目增多。見圖5。們可以發(fā)現(xiàn)在共轉(zhuǎn)染NHE1的PS120 細(xì)胞中野生型的CHP2蛋白主要定位在細(xì)胞膜上，而EF-hand突變的CHP2 蛋白分布在細(xì)胞膜的量相對減少（圖4）。當(dāng)EF-hand被突變，CHP2不能與Ca2+結(jié)合，CHP2 與NHE1的結(jié)合能力減弱，觀測到其在細(xì)胞膜上的定位減少。表明EF-hand是否結(jié)合Ca2+能夠影響CHP2 與NHE1的結(jié)合及其在細(xì)胞膜上定位。

2.5 不同培養(yǎng)條件共表達(dá)NHE1/CHP2 或NHE1/CHP2-EF3m/4m的PS120 細(xì)胞的生長狀態(tài)觀察

在正常有血清培養(yǎng)條件下，共表達(dá)NHE1/CHP2 或NHE1/CHP2-EF3m/4m的PS120 細(xì)胞的生長狀態(tài)無明顯差異，但在去除血清即血清饑餓條件下，筆者發(fā)現(xiàn)共表達(dá)NHE1/CHP2-EF3m/4m的PS120 細(xì)胞隨著培養(yǎng)時間的延長，細(xì)胞的存活數(shù)

3 討論

Ca2+是參與人體各種生命活動與生理過程的重要離子，是細(xì)胞內(nèi)功能最為廣泛的第二信使[7]。Ca2+作為生命活動中的重要調(diào)節(jié)因子，在某些細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路如活化T細(xì)胞核因子信號通路（nuclear factor of activated T cells，NFAT）中發(fā)揮著著重要的作用[8-9]。CHP2 作為Ca2+結(jié)合的蛋白，EF-hand及Ca2+對CHP2 構(gòu)象、功能和活性的影響尚缺乏報(bào)道，值得我們認(rèn)真研究。

筆者的研究表明，CHP2 蛋白結(jié)構(gòu)中有EF-hand3、EF-hand4這兩個與Ca2+結(jié)合的功能性結(jié)構(gòu)。在突變EF-hand3、EF-hand4 以后，CHP2 電泳速度變慢，表明EF-hand對于維持CHP2的正常構(gòu)象非常重要。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證明Ca2+影響CHP2 和NHE1的結(jié)合，Ca2+的存在促進(jìn)CHP2 與NHE1 相結(jié)合；激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，在過表達(dá)NHE1的PS120細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染的GFP標(biāo)記的野生型CHP2 蛋白主要定位在細(xì)胞膜上，而EF-hand3、EF-hand4 突變的CHP2 在細(xì)胞膜上的亞定位減少，在胞漿中的亞定位增加，提示結(jié)合Ca2+及蛋白構(gòu)象改變對CHP2 細(xì)胞內(nèi)分布有重要影響，在活細(xì)胞中證實(shí)了突變CHP2的EF-hand后與NHE1的結(jié)合減少。

CHP2 在多種腫瘤組織中被發(fā)現(xiàn)有異常高表達(dá)，如肝癌、卵巢癌、白血病等[3，10-11]，提示CHP2 在腫瘤的發(fā)生中具有重要作用。CHP2 作為一種腫瘤相關(guān)蛋白，也是膜蛋白NHE1的活性調(diào)節(jié)亞單位，可能通過與NHE1 相互作用在腫瘤發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮重要功能。已有研究證實(shí)腫瘤細(xì)胞內(nèi)NHE1 常常處于過度激活的狀態(tài)，NHE1的過度激活與腫瘤細(xì)胞的異常增殖，遷移與侵襲功能明顯相關(guān)[12]。研究表明，CHP2 可結(jié)合于NHE1 胞漿部分的近膜區(qū)，定位于細(xì)胞膜上，激活NHE1，促進(jìn)離子轉(zhuǎn)運(yùn)，升高細(xì)胞內(nèi)的pH值，有利于細(xì)胞的生存和增殖，從而減少細(xì)胞在血清饑餓的條件下的死亡[13]。本實(shí)驗(yàn)也觀察了血清饑餓條件下共表達(dá)NHE1/CHP2 或NHE1/CHP2-EF3m/4m的PS120 細(xì)胞的存活狀態(tài)，結(jié)果顯示CHP2突變組細(xì)胞在血清饑餓下隨培養(yǎng)時間的延長細(xì)胞存活數(shù)目明顯較野生CHP2 組減少，死亡細(xì)胞增加，而野生CHP2 組細(xì)胞死亡數(shù)量明顯較少，與Pang等[13]的研究結(jié)果一致，表明EF-hand突變后的CHP2 使細(xì)胞抵抗血清饑餓誘導(dǎo)的死亡的能力明顯減弱。本研究結(jié)果進(jìn)一步證明了EF-hand模體結(jié)構(gòu)是CHP2 蛋白結(jié)構(gòu)中的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，當(dāng)其發(fā)生突變后CHP2失去Ca2+結(jié)合能力，同時也減弱了與其靶蛋白NHE1的正常結(jié)合能力，維持細(xì)胞在血清饑餓條件下存活的能力也下降。EF-hand的正常結(jié)構(gòu)及Ca2+的結(jié)合狀態(tài)在CHP2的功能調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。

筆者的研究進(jìn)一步明確了CHP2 發(fā)揮作用的機(jī)制，EF-hand的正確結(jié)構(gòu)及與Ca2+的結(jié)合，對于NHE1 與CHP2的結(jié)合具有重要作用，有助于我們更好地理解CHP2 在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用。然而，對于CHP2 在腫瘤中表達(dá)的具體調(diào)節(jié)機(jī)制仍然研究有限，如CHP2 上游的基因表達(dá)調(diào)控模式如何，什么因素開啟了CHP2 蛋白在腫瘤中的異常表達(dá)等，這些都值得我們?nèi)ダ^續(xù)探索，以進(jìn)一步明確CHP2 在腫瘤中的重要作用。

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