動脈血流對深低溫保存同種瓣膜活性的影響

景鵬宇，梁智星，梁法禹

活性同種瓣膜是心臟瓣膜置換較理想的材料［1，2］，其制備保存方法對瓣膜組織結(jié)構(gòu)及細胞活性影響較大。在常規(guī)制取過程中，由于溫度、壓力等因素驟變，會導(dǎo)致瓣膜各層結(jié)構(gòu)之間產(chǎn)生相互的內(nèi)應(yīng)力［3］，從而損傷瓣膜細胞。本實驗?zāi)M在體環(huán)境，就動脈血流在同種瓣的制備保存中的作用進行初步探討，期望為改進其質(zhì)量提供新方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 供體為1個月～1.5個月齡的中國白兔36只，雌雄不拘，體重（0.3±0.1）kg；受體為成年中國白兔12只，體重（3.0±0.5）kg，由山西醫(yī)科大學(xué)動物中心提供。

1.2 移植物準(zhǔn)備及分組1.2.1 滅菌培養(yǎng)液配置 RPMI1640營養(yǎng)液＋頭孢呋辛鈉50 μg／mL＋二性霉素B 2.5μg／mL（pH 值為7.2，滲透壓為226 mOsm／kg）。

1.2.2 凍存液配置 RM11640培養(yǎng)液：10%小牛血清：二甲基亞砜（DMSO）為8∶1∶1，－20℃凍存［4］。

1.2.3 帶瓣主動脈取材 供體兔腹腔注射戊巴比妥鈉（40.0 mg／kg）麻醉，按常規(guī)動物實驗方法暴露心臟，于主動脈弓分支前剪斷。剝離帶瓣主動脈，去除壁上結(jié)締組織及脂肪組織。于主動脈瓣根部下緣保留約5mm的心肌纖維和心內(nèi)膜，同時保留二尖瓣大瓣，將其修剪成瓣下主動脈壁的一部分。血管長1.2 cm～1.5cm，并縫扎兩冠狀動脈開口。

1.2.4 帶瓣主動脈的滅菌培養(yǎng) 將修剪后的帶瓣血管放入滅菌培養(yǎng)液中，在37℃ 含5%CO2的培養(yǎng)箱中滅菌12h。

1.2.5 分組 將以上標(biāo)本隨機分為A組、B組、C組。A組作為對照組，深低溫液氮保存；B組、C組作為實驗組，頸動脈移植后深低溫液氮保存。

1.3 實驗組處理

1.3.1 同種帶瓣主動脈移植 受體兔耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉（1mL／kg）麻醉，游離雙側(cè)頸動脈。將一側(cè)頸動脈兩端上動脈夾（間隔1.2cm～1.5cm），中間剪斷。采用二定點法等弧度移植帶瓣血管于受體頸動脈。吻合完畢后，讓血管充盈排氣。以同樣的方法移植下一標(biāo)本到對側(cè)頸動脈。每側(cè)吻合限時30min［5］。

1.3.2 術(shù)后管理 清醒后正常飲食，頸部切口不包扎每日消毒3次，給予阿司匹林腸溶片（25mg／d）。術(shù)后不使用抗生素。

1.3.3 移植成功標(biāo)準(zhǔn) 術(shù)后48h受體存活且頸動脈通暢、搏動良好。

1.3.4 取瓣膜標(biāo)本 6只受體兔于術(shù)后48h，將植入的帶瓣血管12份取出，作為B組。另6只于術(shù)后72h取出12份帶瓣血管作為C組。

1.4 深低溫保存 分別放入凍存液中4℃ 滲透平衡15min。使用程控降溫儀以－1℃／min降溫至－80℃ 保存12h，置入液氮罐中保存1個月，復(fù)溫時直接40℃水浴，至解凍后取出主動脈瓣膜。

1.5 細菌學(xué)檢查 滅菌后、從頸動脈取出后以及解凍后取樣，做細菌培養(yǎng)，37℃、72h無細菌生長為陰性。

1.6 指標(biāo)檢測

1.6.1 HE染色及光鏡觀察 主動脈瓣膜用甲醛溶液固定，常規(guī)脫水、二甲苯透明、石蠟包埋后5μm切片，行蘇木精、伊紅（HE）染色，用Olympus光學(xué)顯微鏡觀察。

1.6.2 細胞活性檢測 采用FDA（二乙酸熒光素）／PI（碘化丙啶）雙染、流式細胞儀檢測細胞活率。輕刮去上皮細胞，剪碎后放入裝有10mL膠原酶Ⅱ（200μg／mL）的燒杯內(nèi)，37℃ 水浴2 h，磷酸鹽緩沖液洗滌，1 800r／min離心，取沉淀行FDA／PI雙染色，300目尼龍網(wǎng)過濾，3min～5min內(nèi)將細胞懸液通過流式細胞儀（488nm、200mV）計數(shù)。每份標(biāo)本計數(shù)10 000個細胞，記錄每個標(biāo)本有活性細胞的百分比。

2 結(jié) 果

2.1 肉眼所見 B、C兩組各發(fā)現(xiàn)1只白兔頸部切口感染，解剖后均發(fā)現(xiàn)瓣葉表面有血栓及贅生物附著。3組標(biāo)本解凍后均呈蒼白色，未見明顯的瓣膜斷裂、鈣化等損傷，3組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2 光鏡觀察 3組標(biāo)本纖維質(zhì)層的膠原及彈性纖維清晰可見，室面層內(nèi)膜面可見到不連續(xù)內(nèi)皮細胞存在。低倍鏡下B、C組一個視野內(nèi)均見不到纖維質(zhì)層的膠原及彈性纖維的回折（互成銳角可認為是回折）。A組在一個視野內(nèi)可見到纖維質(zhì)層的膠原及彈性纖維的回折數(shù)目為3個，其纖維質(zhì)層總體皺縮程度較B組、C組大。3組室面層皺縮程度差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3 細胞活性（見表1） B組、C組均有1只兔出現(xiàn)切口感染，均未計入。

表1 3組細胞活率比較（±s） %

表1 3組細胞活率比較（±s） %

組別 n 細胞活率A組（0h）12 89.75±0.55 B組（48h） 11 90.68±0.371）C組（72h） 11 90.77±0.551）與A組比較，1）P＜0.05

3 討 論

目前，臨床使用的同種瓣膜多采用含抗生素的培養(yǎng)液滅菌、戊二醛／二甲基亞砜冷凍保護液處理，液氮深低溫保存。臨床應(yīng)用顯示了良好的近中期效果，其壽命在15年～20年［3］，但長期耐久性還有待提高。因此，如何改進同種瓣的制備保存方法，提高其保存質(zhì)量，成為活性同種瓣移植基礎(chǔ)和臨床研究的熱點。

瓣葉的基本組織結(jié)構(gòu)分為三層：從內(nèi)向外依次為有大量內(nèi)皮細胞覆蓋的心室面層，由疏松排列的膠原纖維、成纖維細胞和富含蛋白多糖的細胞外基質(zhì)組成的海綿層，由成纖維細胞、其他類型的結(jié)締組織和致密的膠原纖維束組成的纖維質(zhì)層［6］。近年研究發(fā)現(xiàn)，在瓣膜制備保存中，即使是在零壓力下固定，瓣葉的纖維質(zhì)層和室面層之間仍存在相互對抗的內(nèi)應(yīng)力，室面層處于張力狀態(tài)，伸展性較小，而纖維質(zhì)層處于皺縮狀態(tài)，具有良好的伸展性，這種殘余應(yīng)力會損傷瓣膜內(nèi)部結(jié)構(gòu)［3］。本實驗顯示動脈血流可使同種瓣纖維質(zhì)層舒展，以減小纖維質(zhì)層和室面層之間相互對抗的內(nèi)應(yīng)力對細胞的損傷，提高同種瓣細胞活率，對于瓣膜移植后的耐久性有更好的預(yù)期。

然而，在本實驗中尚未進一步控制頸動脈血流速度、壓力大小等因素，這將是下一步研究的方向。我們可以體外模擬頸動脈血流循環(huán)，更好地控制壓力、溫度、血壓飽和度等相關(guān)因素，來處理供體瓣膜，更進一步方便于臨床瓣膜制備保存，以減小瓣膜結(jié)構(gòu)損傷，提高細胞活率。

動脈血流可減小瓣膜室面層與纖維質(zhì)層之間的舒縮程度差異，減小瓣膜保存過程中的細胞損傷，其機制可能與動脈血流的機械力作用相關(guān)，還有待進一步研究。

［1］Malakh S，Nawid K，Hassina B，etal.Aortic root reoperation：A technical challenge［J］.J Heart Valve Dis，2010，19（2）：177－181.

［2］Jin XY，Zhang ZM，Gibson DG，etal.Effects of valve substitute on changes in left ventricular function and hypertrophy after aortic valve replacement［J］.Ann Thorac Surg，1996，62（3）：683－690.

［3］張寶林，徐志云.心臟瓣膜外科學(xué)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2007：230－234.

［4］李新民，惠麗萍，劉建實，等.同種帶瓣主動脈的制備及其保存［J］.中華胸心血管外科雜志，1995，11（1）：54.

［5］張晶，劉迎龍.兔頸動脈移植同種主動脈帶瓣血管模型的建立［J］.中華實驗外科雜志，2000，17（6）：568－569.

［6］Masoud M，Edgar B，Mahbubul L，etal.A new storage solution for porcine aortic valves［J］.Ann Thorac Cardiovasc Surg，2007，13（2）：102－108.