ABCA1基因V825I多態(tài)性與腔隙性腦梗死合并高血壓病的相關(guān)性研究1）

薛偕華，黃賽娥，吳加勇，洪江從，林志誠，林高城，吳成翰

ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運子A1（ATP binding cassette transporter 1，ABCA1）是一種整合膜蛋白，它以ATP為能源，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇和磷脂的流出，后者結(jié)合到細(xì)胞表面的載脂蛋白A1（apoH1），形成新生的高密度脂蛋白膽固醇（HDL－C），參與膽固醇逆向轉(zhuǎn)運而發(fā)揮抗動脈粥樣硬化的作用。研究表明ABCA1基因變異導(dǎo)致HDL－C缺陷伴早發(fā)動脈粥樣硬化［1］。近來有大量文獻(xiàn)表明，ABCA1基因單核苷酸多態(tài)性（SNP）與血漿脂質(zhì)水平和動脈粥樣硬化易感性有著密切的相關(guān)性［2－5］。V825I是ABCA1基因編碼區(qū)17號外顯子的一個SNP位點，在第六個跨膜結(jié)構(gòu)的α螺旋中由GTC變異為ATC，可能對ABCA1蛋白活性產(chǎn)生影響。V825I與缺血性心臟病及血脂的研究較多，在不同的人群結(jié)果往往不一致［6－11］，而且V825I在腔隙性腦梗死合并高血壓病的研究尚未見報道。因此，本研究采用病例對照研究方式探討V825I多態(tài)與腔隙性腦梗死合并高血壓病的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 研究對象 病例來源于2008年9月—2011年6月在福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院住院部和門診的腔隙性腦梗死伴高血壓病患者。病例組共97例，男61例，女36例；年齡48歲～83歲（67.7歲±10.5歲）。腔隙性腦梗死嚴(yán)格按照1990年腦血管?、蟮臉?biāo)準(zhǔn)診斷［12］。所有病例都經(jīng)磁共振成像（MRI）或CT平掃證實。對照組129例，為福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院體檢中心的無高血壓病及無心腦血管疾病人群，其中男77例，女52例，年齡43歲～80歲（59.2歲±9.6歲）。觀察對象均排除肝、腎、內(nèi)分泌等影響脂質(zhì)代謝的疾病、心房纖顫、周圍血管疾病、大動脈炎、血液病、結(jié)核、惡性腫瘤及入院前2周內(nèi)使用降脂等藥物者。在收集血液標(biāo)本的同時，收集每個研究對象詳細(xì)的人口學(xué)資料。兩組均為福建省漢族人，無血緣關(guān)系。以上研究對象均進(jìn)行血糖、血脂、血壓等檢查，高血壓病的診斷標(biāo)準(zhǔn)為血壓≥140／90mmHg（1mmHg＝0.133kPa），糖尿病的診斷標(biāo)準(zhǔn)為空腹血糖≥7.0mmol／L或餐后2h血糖≥11.1mmol／L。

1.2 生化檢測 空腹12h后采取外周靜脈血，分離血清。全自動生化分析儀測定總膽固醇（TC）、三酰甘油 （TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL－C）、HDL－C、apoA1及血糖。

1.3 基因組DNA提取和PCR擴增 空腹抽取靜脈血2mL以ACD抗凝，以外周血基因組DNA提取試劑盒（QIAGENE）提取。反應(yīng)使用9700型PCR擴增儀，體系25μL。含有大約100ng基因組 DNA，50pmol／μL上下游引物0.5μL（引物：F 5’－ gAgACTgACCAggAAATgg －3’R 5’－ ATgCACTg－CAgAgATTCTAg－3’），20mmol／L dNTP 0.5μL，10×PCR緩沖液2.5μL，TaqDNA聚合酶1.25U，用去離子水補至25 μL。擴增程序為：94℃預(yù)變性2min，然后94℃變性30s，61℃退火45s，72℃延伸60s，共30個循環(huán)；最后72℃延伸5 min。17號外顯子V825I位點的PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶BsaI（NEB公司）于50℃酶切過夜，反應(yīng)體系為20μL：PCR反應(yīng)產(chǎn)物8μL，內(nèi)切酶2U，NEBuffer3 2μL，去離子水補至20 μL。酶切產(chǎn)物在3%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，溴乙啶染色，紫外燈下觀察電泳結(jié)果并確定基因型，D2000有100bp到2000bp作為標(biāo)記。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 以χ2檢驗驗證入選人群是否符合Hardy－Weinberg遺傳平衡定律以及各組的基因型頻率和等位基因頻率，以χ2檢驗或Student’st檢驗比較人口學(xué)特征，吸煙、飲酒狀況，血脂水平等。多因素Logistic回歸計算比值比（odds ratios，OR）及其95%可信區(qū)限（confidence intervals，CI）表示相對風(fēng)險度。所有的統(tǒng)計檢驗均為雙側(cè)概率檢驗。統(tǒng)計軟件為SPSS11.5版。

2 結(jié) 果

2.1 兩組基礎(chǔ)資料比較 兩組性別、酒精攝入、吸煙、TC、TG和LDL－C差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。但病例組患者年齡高于對照組，血漿TC、HDL－C和apoA1水平低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。詳見表1。

表1 兩組基礎(chǔ)資料比較

2.2 基因型頻率和等位基因頻率分布情況 V825I多態(tài)性位點的PCR擴增產(chǎn)物長330bp，經(jīng)BsaI酶切后，V等位基因被切為184bp和164bp兩個片段，而I等位基因由于無酶切位點仍為一個330bp的片段，所以VV基因型含有184bp和164bp兩個片段，Ⅵ基因型含有330bp和184bp、146bp三個片段，Ⅱ基因型僅有330bp一個片段。ABCA1基因V825I各組人群經(jīng)Hardy－Weinberg遺傳平衡定律檢驗差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），說明具有人群代表性?；蛐图暗任换蝾l率分布情況見表2。ABCA1基因V825I位點基因型頻率在病例組與對照組比較分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝7.22，P＜0.05），等位基因頻率在兩病例組與對照組分布差異也有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝6.59，P＜0.05）。為了進(jìn)一步闡明這種相關(guān)性，對年齡、性別、血脂水平、吸煙等危險因素進(jìn)行校正行Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，與VV基因型比較，II基因型患病的風(fēng)險顯著降低（OR：0.31，95%CI：0.13～0.72）。

表2 基因型頻率和等位基因頻率分布 例（%）

2.3 V825I各基因型與血脂的相關(guān)分析（見表3） VV、VI、II三種基因型與各血脂成分TC、TG、LDL－C、HDL－C之間未見明顯相關(guān)性。雖然apoA1水平在VV、VI、II三種基因型中有逐漸升高趨勢，但差異仍無統(tǒng)計學(xué)意義。

表3 V825I多態(tài)不同基因型與血脂水平的關(guān)系（±s） mmol／L

表3 V825I多態(tài)不同基因型與血脂水平的關(guān)系（±s） mmol／L

血脂VV VI II TC 4.93±0.95 5.03±0.99 4.81±0.87 TG 1.53±0.87 1.82±0.92 1.80±0.90 LDL－C 3.07±0.83 3.06±0.82 2.97±0.71 HDL－C 1.17±0.29 1.21±0.28 1.17±0.36 apoA1 1.21±0.27 1.25±0.21 1.26±0.23

3 討 論

ABCA1基因位于9q31，含有50個外顯子，49個內(nèi)含子。ABCA1基因上有多個SNP位點，研究表明多數(shù)SNP位點能影響血脂水平、動脈硬化的嚴(yán)重程度［7，8］。V825I是ABCA1基因編碼區(qū)重要的SNP位點，其在歐洲人群的等位基因頻率較低，丹麥825I等位基因頻率為6%，荷蘭為8.1%，北愛爾蘭約為5.6%，而在亞洲人群825I等位基因頻率在40%～50%。Cao等［13］研究表明，在中國廣西漢族人群中825I等位基因頻率分布為42.3%。在本研究中對照組的I等位基因頻率分布為49.2%，VV、VI、II基因型頻率分別為25.6%、50.4%、24.0%。目前對ABCA1基因V825I位點的研究主要集中在血脂水平及缺血性心臟病易感性方面，而且在不同的人群結(jié)果往往不相一致［6－11］。Frikke－Schmidt等［7］研究提示，在丹麥人群中825I攜帶者具有較高的HDL－C水平，Kyriakou等［8］對V825I位點的體外研究發(fā)現(xiàn)，與表達(dá)825V的細(xì)胞比較，表達(dá)825I的細(xì)胞對H3標(biāo)記膽固醇的排出率較高，提示825I具有更強的ABCA1活性，其HDL－C生成水平較高。Tan等［6］報道V825I位點與新加坡的馬來人群的缺血性心臟病具有相關(guān)性，與新加坡華人的血脂水平及心臟病易感性無明顯關(guān)系。Clee等［4］研究提示V825I與血漿HDL－C的水平無明顯相關(guān)，但是與缺血性心臟病的發(fā)病風(fēng)險有顯著相關(guān)。Li等［10］研究提示，中國漢族人群中V825I多態(tài)與apoA1的水平有關(guān)，這種相關(guān)性依賴于V825I和R1587K的單倍型的構(gòu)成情況。而Cao等［13］研究表明，在中國廣西漢族人群中V825I基因型與HDL－C、apoA1的水平相關(guān)。這種不一致的研究結(jié)果，V825I位點對血脂、疾病易感性的影響與人群種族、飲食、環(huán)境因素等密切相關(guān)。在本研究中發(fā)現(xiàn)腔隙性腦梗死伴高血壓病患者V825I的基因型頻率和等位基因頻率與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），經(jīng)Logistic回歸分析表明，II基因型者患病的風(fēng)險僅為VV基因型的0.31。而在基因型和血脂水平的關(guān)系研究中未見V825I與TC、TG、LDL－C、HDL－C的水平有關(guān)，這與Tan等研究結(jié)果一致。雖然apoA1的水平隨VV、VI、II逐漸升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，有待擴大樣本量進(jìn)一步證實。同時本研究尚未對R1587K位點進(jìn)行檢測，未能進(jìn)一步證實Li等研究結(jié)果。

在中國福建地區(qū)的漢族人群中，ABCA1基因V825I位點與腔隙性腦梗死合并高血壓病有相關(guān)性，II基因型具有一定保護(hù)因素；V825I位點與血漿apoA1的關(guān)系有待在不同人群中和擴大樣本數(shù)進(jìn)一步證實。

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