正交實驗法優(yōu)化牛鼻軟骨中硫酸軟骨素的醇沉工藝

李利曉，夏延斌，2，*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖南長沙 410128；2.國家蔬菜加工技術(shù)研發(fā)分中心，湖南長沙 410128）

正交實驗法優(yōu)化牛鼻軟骨中硫酸軟骨素的醇沉工藝

李利曉1，夏延斌1，2，*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖南長沙 410128；2.國家蔬菜加工技術(shù)研發(fā)分中心，湖南長沙 410128）

研究牛鼻軟骨堿提液中硫酸軟骨素的醇沉工藝。通過單因素和正交實驗對醇沉工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定的最佳條件是：乙醇濃度65%，乙酸鈉濃度4.5%，pH6.0。在該條件下，提取率為14.81%，葡萄糖醛酸含量33.36%，硫酸軟骨素純度達(dá)85.9%。紫外光譜分析：樣品在196nm處有多糖的吸收峰，未見蛋白質(zhì)（280nm）與核酸（260nm）的特征吸收峰。

正交實驗，硫酸軟骨素，醇沉工藝

Abstract：The ethanol deposition technology of chondroitin sulfate was studied in the paper，witch was extracted from bovine nose cartilage hydrolyzed by alkaline solution.The optimal ethanol deposition conditions of chondroitin sulfate were explored by single factor and orthogonal experiments to be ethanol solution of 65%，sodium acetate solution of 4.5%，pH6.0.Under the optimal conditions，the yield was 14.81%，the content of glucuronic acid was 33.36%，the purity quotient of chondroitin sulfate was 85.9%．UV analysis revealed that the absorption peak of chondroitin sulfate appears at 196nm，while characteristic absorption peaks of protein（280nm）and nucleic acid（260nm）were not found．

Key words：orthogonal test；chondroitin sulfate；ethanol precipitation techniques

硫酸軟骨素（Chondroitin Sulfate，ChS）是來自動物喉骨、鼻軟骨、氣管等富含軟骨組織的一類重要酸性黏多糖，根據(jù)分子結(jié)構(gòu)中糖環(huán)上硫酸酸基取代位置的不同，主要分為硫酸軟骨素A和硫酸軟骨素C兩種類型。ChS具有多種生物活性，具有抗炎、抗癌、抗HIV、降血脂、抗凝血活性、預(yù)防關(guān)節(jié)炎、減輕打鼾、改善食物風(fēng)味、口感、光澤，保濕性[1-3]等重要生物活性。目前，臨床醫(yī)學(xué)上已用于骨關(guān)節(jié)炎（OA）、冠心病[4]、偏頭痛[5]等；生物醫(yī)學(xué)中主要用于生物膜、活性腳手架、人工骨類的構(gòu)建；同時也廣泛用于化妝品和保健食品[6]等行業(yè)，有非常廣闊的開發(fā)前景。中國牛飼養(yǎng)量占據(jù)世界首位，牛骨綜合利用率低，牛軟骨中含有豐富的硫酸軟骨素，以前文獻(xiàn)也沒有系統(tǒng)的報道過以牛骨為原料提取硫酸軟骨素的醇析工藝。因此，本文以牛鼻軟骨為原料，旨在充分從牛鼻軟骨粉的堿提液中醇析出硫酸軟骨素的有效成分，采用正交和單因素相結(jié)合的實驗方法對硫酸軟骨素的醇沉工藝進(jìn)行探討，為硫酸軟骨素的純化精制工藝提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

軟骨粉堿提液 實驗室自制（保存在4℃）；無水乙醇、無水乙酸鈉、濃硫酸、咔唑、色譜純乙腈、戊烷磺酸鈉等 均為分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；硫酸軟骨素A Sigma公司。

富磁pHS-3C pH計 上海精隆科學(xué)儀器有限公司；DHG-924OA電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海飛越實驗儀器有限公司；UV-2450島津紫外分光光度計 日本島津公司；Agilent1100serie高效液相色譜儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 堿提液醇沉工藝[7-9]堿提液→調(diào)節(jié)pH→4000r/min，離心20min過濾→取上清液→加入無水乙酸鈉、無水乙醇至一定濃度→4℃靜置一夜→5000r/min，離心20min過濾→洗滌60℃干燥→粗品粉末

1.2.2 醇沉工藝的正交和單因素實驗 影響硫酸軟骨素醇沉工藝的因素很多，在參考文獻(xiàn)[10-13]的基礎(chǔ)上，選用乙酸鈉濃度、pH、乙醇濃度三個關(guān)鍵因素作為實驗因素，以硫酸軟骨素提取率、葡萄糖醛酸含量為指標(biāo)，進(jìn)行三因素三水平L9（33）的正交實驗，確定最佳醇沉工藝參數(shù)，正交實驗設(shè)計見表1所示，然后在正交實驗的基礎(chǔ)上進(jìn)行單因素實驗，進(jìn)一步的優(yōu)化醇沉工藝參數(shù)。

表1 正交實驗的因素水平設(shè)計Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments

1.2.3 測定方法

1.2.3.1 硫酸軟骨素提取率測定 硫酸咔唑法[14-16]：硫酸軟骨素中主要包含葡萄糖醛酸（GlcA）、氨基己糖和硫酸根，樣品中葡萄糖醛酸的總質(zhì)量能間接反映硫酸軟骨素的含量，而且測定方法簡單，可以進(jìn)行大規(guī)模篩選實驗，本文主要以粗品中葡萄糖醛酸的總質(zhì)量（硫酸咔唑法）反映硫酸軟骨素提取率的高低。

1.2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 精密量取對照品溶液（40μg/mL）：0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、0.9、1.0mL分別置于25mL具塞試管，用蒸餾水定至1mL，混勻，得到一系列的葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。于冰鹽浴條件下緩緩加入5mL 0.025mol/L四硼酸鈉溶液-濃硫酸，其間注意避免出現(xiàn)沸騰的現(xiàn)象。置于90℃水浴加熱20min（中間振搖一次），迅速冷卻，分別加0.2%咔唑-無水乙醇溶液0.2mL，搖勻，置于90℃水浴中，加熱20min（中間振搖一次），冷卻至室溫于530nm比色，根據(jù)吸光值（y）和葡萄糖醛酸的濃度（x）繪制其標(biāo)準(zhǔn)曲線，得y=0.0113x+0.002，R=0.9996。

1.2.3.3 樣品中糖醛酸含量測定 取供試品溶液1mL（40～100μg/mL），同時做3個重復(fù)，以蒸餾水作為參比，按上述標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定方法，分別測定其吸光度，計算樣品中的葡萄糖醛酸含量。

式中：m為粗品中葡萄糖醛酸總質(zhì)量（g）；M1為風(fēng)干粗品質(zhì)量（g）。

式中：m為粗品中葡萄糖醛酸總質(zhì)量（g）；M為原料風(fēng)干樣品質(zhì)量（g）。

1.2.3.4 硫酸軟骨素純度測定 液相色譜法[18]。

1.2.3.5 硫酸軟骨素的紫外光譜分析[19-20]以蒸餾水調(diào)零，在190～400nm波長范圍內(nèi)對0.5mg/mL的多糖溶液進(jìn)行紫外掃描，觀察260和280nm處多糖水溶液的紫外吸收情況。

1.2.3.6 數(shù)據(jù)處理 采用minitab15和Excel2003進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 醇沉工藝的正交實驗[21]

將堿提取液平均分成9等份，按表1條件進(jìn)行醇沉。數(shù)據(jù)處理采用加權(quán)評分法，評分標(biāo)準(zhǔn)為：設(shè)定葡萄糖醛酸含量（X）和硫酸軟骨素提取率（Y）兩者的權(quán)重系數(shù)均為1，對兩項指標(biāo)進(jìn)行加權(quán)求和。通過公式Z=X+Y，得到綜合評分（Z），正交實驗結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表2 正交實驗結(jié)果Table 2Results of L9（34）orthogonal test and range analysis

表3 正交實驗綜合評分的方差分析表Table 3 Analysis of variance for results of comprehensive score of orthogonal test

注：p＜0.05，因素影響顯著；p＜0.01，因素影響極顯著；p＞0.05，因素影響不顯著。

由表2可知，影響硫酸軟骨素醇沉工藝的主次因素順序為：乙醇濃度（C因素）＞乙酸鈉濃度（A因素）＞pH（B因素），根據(jù)k值和R值得最優(yōu)工藝參數(shù)選擇A3B1C1，即乙酸鈉濃度4%，pH6.0，乙醇濃度65%，以最佳參數(shù)得到的產(chǎn)品中葡萄糖醛酸含量33.16%，ChS提取率14.64%，綜合評分47.8，高于正交實驗表中的任一組工藝；從表3的方差分析可知，醇沉體系中乙醇濃度影響極顯著（p＜0.01），乙酸鈉濃度影響顯著（p＜0.05），pH影響不顯著（p＞0.05）。因此為了得到更佳的工藝方案，本實驗進(jìn)一步采用醇沉體系中乙醇濃度、乙酸鈉濃度為因素，以葡萄糖醛酸含量和硫酸軟骨素提取率為指標(biāo)，進(jìn)行單因素實驗來確定工藝參數(shù)最優(yōu)值。

2.2 醇沉工藝的單因素實驗

2.2.1 乙醇濃度對硫酸軟骨素醇沉效果的影響 將堿提取液（提取液中多糖濃度保持在1%～2%[8]）平均分成7等份，按提取液體積加入無水乙酸鈉，攪拌溶解使體系中乙酸鈉濃度為4%，調(diào)節(jié)pH為6.0，然后分別加入無水乙醇至醇沉體系的乙醇濃度分別50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%（v/v），4℃下靜置一夜，5000r/min離心20min，收集沉淀，研究不同乙醇濃度對硫酸軟骨素醇沉效果的影響，結(jié)果見圖1。

從圖1可知，醇沉體系中，不同的乙醇濃度對ChS提取率和產(chǎn)品中葡萄糖醛酸含量的影響很大，這與上文的正交實驗結(jié)果一致。當(dāng)乙醇濃度為50%～65%時，ChS提取率呈上升趨勢，當(dāng)乙醇濃度大于65%后，隨著乙醇濃度的增加，提取率下降。這是由于乙醇濃度的升高，提高了一些蛋白質(zhì)的溶解度，使ChS也隨之溶于乙醇溶液中而沒有被沉降下來，同時，也會降低一些醇溶性雜質(zhì)和親脂性較強類物質(zhì)的溶解度，使其溶出量增加，降低多糖溶出量，兩者共同導(dǎo)致了ChS提取率的降低；還可以看出，當(dāng)乙醇濃度為50%～65%時，產(chǎn)品中葡萄糖醛酸的含量呈穩(wěn)定趨勢，當(dāng)乙醇濃度大于65%后，葡萄糖醛酸的含量因為某些雜質(zhì)蛋白和有機鹽離子的大量析出而迅速下降。綜合考慮得知，65%為最佳的乙醇沉淀濃度。許琳[22]研究可知，乙醇濃度對多糖提取率的大小，主要取決于多糖的相對分子質(zhì)量的大小和分子的形狀。一般情況下，多糖的分子質(zhì)量越大，被沉淀下來所需的乙醇體積分?jǐn)?shù)就越小，由此發(fā)現(xiàn)稀堿法提取的ChS相對分子質(zhì)量很大，保持了多糖的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

圖1 醇沉體系中乙醇濃度對葡萄糖醛酸含量和ChS提取率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the content ofglucuronic acid and extraction rate of chondroitin sulfate in the ethanol precipitation system

2.2.2 乙酸鈉濃度對硫酸軟骨素醇沉效果的影響將堿提取液（提取液中多糖濃度保持在1%～2%）平均分成7等份，按提取液體積加入無水乙酸鈉，攪拌溶解使體系中乙酸鈉濃度分別為2%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%（g/mL），調(diào)節(jié)pH為6.0，然后分別加入無水乙醇至醇沉體系的乙醇濃度為65%（v/v），4℃下靜置一夜，5000r/min離心20min，收集沉淀，研究不同乙酸鈉濃度對硫酸軟骨素醇沉效果的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 醇沉體系中乙酸鈉濃度對葡萄糖醛酸含量和ChS提取率的影響Fig.2 Effect of sodium acetate concentration on the content of glucuronic acid and extraction rate of chondroitin sulfate in the ethanol precipitation system

從圖2可知，隨著醇沉體系中乙酸鈉濃度的增大，產(chǎn)品中葡萄糖醛酸含量增加，這是因為[23]鹽離子破壞了硫酸軟骨素與水分子之間強烈的吸附作用，使之溶解度降低而大量聚集沉降析出，在乙酸鈉濃度5%時達(dá)到最高。而當(dāng)鹽離子濃度過大時，一些蛋白質(zhì)變性沉降從而降低了ChS的析出量，葡萄糖醛酸含量下降。還可得知，ChS提取率的變化趨勢與葡萄糖醛酸含量基本一致，在乙酸鈉濃度4.5%時ChS提取率達(dá)高峰；當(dāng)鹽離子濃度過大時，一些雜質(zhì)（某些蛋白質(zhì)和有機鹽）溶出率增大，造成ChS溶出量減少使提取率降低。醇沉過程的主要目的是最大程度的沉淀硫酸軟骨素，所以從節(jié)約成本角度選取4.5%為最佳的乙酸鈉濃度。

2.3 驗證實驗

最終得出的硫酸軟骨素最佳醇沉工藝為：調(diào)節(jié)堿提液pH6.0，按提取液體積加入4.5%乙酸鈉為助沉劑，攪拌溶解后加入沉淀劑無水乙醇至體系中乙醇濃度達(dá)65%，在4℃冰箱中靜置一夜，5000r/min離心20min，收集沉淀用無水乙醇洗滌數(shù)次，于60℃烘箱中干燥至無純味，得到粗品粉末，干燥保存。重復(fù)三次進(jìn)行實驗驗證發(fā)現(xiàn)，粗品葡萄糖醛酸含量33.36%，ChS提取率為14.81%。

2.4 紫外光譜

將粗多糖產(chǎn)品配制成0.5mg/mL的溶液，以蒸餾水做空白對照，在波長190～400nm之間掃描得紫外掃描圖譜如圖3所示。

圖3 產(chǎn)品的紫外光譜Fig.3 UV spectrum of product

圖3表明，樣品在波長196nm附近有葡萄糖醛酸的典型吸收峰，280nm處沒顯示出蛋白質(zhì)吸收峰，260nm處無紫外吸收，說明無核酸存在。

3 結(jié)論與討論

采用乙酸鈉代替?zhèn)鹘y(tǒng)的助沉劑氯化鈉作為多糖醇沉體系中的助沉劑，優(yōu)點在于乙酸鈉在乙醇中的溶解度很大，不容易隨著硫酸軟骨素一起沉淀，產(chǎn)品純度提高，有利于后續(xù)產(chǎn)品的精制純化。另外，在乙醇沉淀分離時，還需注意一些操作事項：a.提取液需冷卻后再加入乙醇，以免乙醇受熱揮發(fā)損失；b.醇沉?xí)r慢加快攪，即快速攪拌藥液，緩緩加入乙醇，以避免局部醇濃度過高造成有效成分被包裹損失，促進(jìn)硫酸軟骨素迅速聚集沉降，獲得較好的得率，提高了生產(chǎn)效率。

經(jīng)過正交實驗和單因素實驗確定ChS堿提液的最佳醇沉工藝為：乙醇濃度65%，乙酸鈉濃度4.5%，pH 6.0，沉淀經(jīng)干燥后得到白色粉末產(chǎn)品。在此條件下，重復(fù)三次進(jìn)行驗證得ChS提取率為14.81%，葡萄糖醛酸含量33.36%，硫酸軟骨素純度達(dá)85.9%，超過國家出口標(biāo)準(zhǔn)（84.6%）。

紫外光譜分析，260及280nm處沒有最大吸收，說明產(chǎn)品基本不存在蛋白質(zhì)和核酸。

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Optimization of ethanol precipitation techniques for chondroitin sulfate from bovine nose cartilage with orthogonal test

LI Li-xiao1，XIA Yan-bin1，2，*
（1.Food Science and Technology，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China；2.National R＆D Branch Center for Vegetable Processing，Changsha 410128，China）

TS201.1

B

1002-0306（2012）16-0261-04

2012－02－01 *通訊聯(lián)系人

李利曉（1984-），女，碩士研究生，研究方向：食品化學(xué)與營養(yǎng)。

湖南省科技創(chuàng)新項目（60030183711）。