茶中游離氨基酸測(cè)定標(biāo)樣的選擇

馬雪瀧，鄒鵬飛，王蕩強(qiáng)，曹順利，房江育，，*，王 昶

（1.黃山學(xué)院生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，安徽黃山 245041;2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶葉生物化學(xué)與生物技術(shù)農(nóng)業(yè)部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥 230036;3.黃山先農(nóng)生物科技有限公司，安徽黃山 245900)

茶中游離氨基酸測(cè)定標(biāo)樣的選擇

馬雪瀧1，鄒鵬飛1，王蕩強(qiáng)1，曹順利2，房江育1，3，*，王 昶3

（1.黃山學(xué)院生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，安徽黃山 245041;2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶葉生物化學(xué)與生物技術(shù)農(nóng)業(yè)部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥 230036;3.黃山先農(nóng)生物科技有限公司，安徽黃山 245900)

茶中游離氨基酸測(cè)定中，國家標(biāo)準(zhǔn)沒有對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品谷氨酸和茶氨酸加以區(qū)別，造成這一指標(biāo)測(cè)定結(jié)果的混亂。運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)成對(duì)比較t檢驗(yàn)方法，將2種標(biāo)樣的2個(gè)吸光度、按2種標(biāo)樣算出的樣品的2種氨基酸含量以及文獻(xiàn)中2種標(biāo)樣下游離氨基酸的2種含量分別一一配對(duì)，進(jìn)行樣本差數(shù)方差分析，結(jié)果表明，谷氨酸的吸光度高于茶氨酸，達(dá)到極顯著水平，且差異隨著氨基酸量的增加而增大;樣品游離氨基酸含量谷氨酸標(biāo)樣測(cè)定結(jié)果普遍低于茶氨酸測(cè)定結(jié)果，差異達(dá)到極顯著或顯著水平。根據(jù)茶中各種氨基酸各自的含量和分子量，用加權(quán)法計(jì)算出混合氨基酸的相對(duì)平均分子量為147～150u，與谷氨酸分子量147.1u接近，偏離茶氨酸分子量174.2u;此外，谷氨酸吸光值高，測(cè)定更加靈敏。為此，認(rèn)為茶中游離氨基酸測(cè)定的國家標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)該保留谷氨酸做標(biāo)樣，取消茶氨酸作標(biāo)樣。

茶，氨基酸，國標(biāo)，標(biāo)樣，谷氨酸

氨基酸是茶葉中的主要化學(xué)成分之一，占茶葉干重的1%～4%，已發(fā)現(xiàn)26種[1]，其與茶葉的滋味和香氣密切相關(guān)，是構(gòu)成茶葉品質(zhì)的重要成分之一。準(zhǔn)確地測(cè)定茶葉游離氨基酸量對(duì)于了解茶葉質(zhì)量非常重要。目前我國茶葉中游離氨基酸總量的測(cè)定采用國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 8314-2002[2]。其原理是α-氨基酸與茚三酮反應(yīng)形成紫色絡(luò)合物，在570nm波長(zhǎng)具有最大吸收，顏色深度與氨基酸含量成正比。標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定使用的標(biāo)準(zhǔn)物為茶氨酸或谷氨酸，沒有說明二者有什么區(qū)別。但在實(shí)際測(cè)定中，各實(shí)驗(yàn)室用谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定的氨基酸含量普遍低于用茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定結(jié)果[3-5]。然而，對(duì)這一問題雖有所認(rèn)識(shí)，卻鮮有對(duì)這種差別進(jìn)行系統(tǒng)分析。在茚三酮比色中，參與反應(yīng)的是氨基酸分子中的α-氨基，因此氨基酸分子數(shù)目越多，顯色反應(yīng)越強(qiáng);質(zhì)量相同、分子量不同的氨基酸因含有的氨基數(shù)不同，吸光值也不同。谷氨酸分子量為147.13u，茶氨酸分子量為174u，質(zhì)量相同時(shí)，谷氨酸分子數(shù)多于茶氨酸，吸光值較高。此外，茶中游離氨基酸為20多種氨基酸的混合物，吸光值的大小不僅與質(zhì)量總和有關(guān)，也與各氨基酸分子數(shù)目有關(guān)。為此，用谷氨酸和茶氨酸同時(shí)做標(biāo)樣，進(jìn)行茶中氨基酸測(cè)定，對(duì)2種標(biāo)樣的吸光值和據(jù)此算出的茶樣氨基酸含量以及相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[4-5]分別進(jìn)行生物統(tǒng)計(jì)學(xué)成對(duì)數(shù)據(jù)平均數(shù)比較的單尾t檢驗(yàn)，辨析谷氨酸標(biāo)樣和茶氨酸標(biāo)樣之間的差異的本質(zhì)所在。此外，對(duì)茶葉中各游離氨基酸進(jìn)行加權(quán)平均分子量的計(jì)算，以便選擇更接近茶中氨基酸實(shí)際情況的標(biāo)準(zhǔn)樣品。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

信陽毛尖一級(jí)綠茶、祁門紅茶特級(jí)和一級(jí)紅茶市場(chǎng)購買;茶樹（Camellia sinensisL.) 楊樹林品種，種子萌發(fā)、生長(zhǎng)在硝態(tài)氮∶銨態(tài)氮分別為40∶0、30∶10、20∶20、10∶30和0∶40的營養(yǎng)條件下，4個(gè)月后取茶苗的根和芽葉;茶樹（Camellia sinensisL.) 櫧葉種、藪北品種，14月齡茶苗的根和芽葉;茚三酮（含量≥95.0%)、L-茶氨酸（含量≥99%)上海源聚生物科技有限公司;L-谷氨酸（含量≥99%) 上海展云化工有限公司;磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀 汕頭西隴化工股份有限公司，分析純。

721型分光光度計(jì) 上海第三儀器分析廠;AB204N分析天平 梅特勒一托利多儀器（上海)有限公司;HH.S 21-6V型電熱恒溫水浴鍋 上海醫(yī)療器械五廠;SZ202-1型電熱恒溫干燥箱 浙江諸暨電熱儀器廠;PHS-2C型精密酸度計(jì) 上海隆拓儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)樣的配制 用于游離氨基酸測(cè)定的谷氨酸和茶氨酸標(biāo)樣按照GB/T 8314-2002配制。將2種標(biāo)準(zhǔn)工作液在濾紙上梯度點(diǎn)樣后，用酒精-茚三酮展層。

1.2.2 試液的制備 a.一級(jí)綠茶（信陽毛尖)和特級(jí)紅茶（祁門紅茶)試液按照GB/T 8312-2002制備。b.取烘干、粉碎的茶苗芽葉或根0.2～0.5g，加入100mL水，100℃水浴中浸提60min，冷卻，過濾，定容至100mL。

1.2.3 測(cè)定 樣品游離氨基酸測(cè)定按照GB/T 8314-2002進(jìn)行，另送2份一級(jí)和1份特級(jí)祁門紅茶至中國農(nóng)科院茶葉研究所（中茶所)進(jìn)行游離氨基酸檢測(cè)。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理與計(jì)算 因本實(shí)驗(yàn)探討2種標(biāo)樣對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，所以省略計(jì)算樣品中游離氨基酸的實(shí)際質(zhì)量步驟，僅以試液游離氨基酸為比較對(duì)象，參加比較的還有相同質(zhì)量谷氨酸和茶氨酸標(biāo)樣的吸光值和文獻(xiàn)[4-5]中的數(shù)據(jù)。分別計(jì)算以上4種情況中各成對(duì)數(shù)據(jù)的差值，求出差值平均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)誤差和t值，與各自由度下查出的t0.01值或t0.05值進(jìn)行比較，做出推斷。綜合送檢茶樣氨基酸測(cè)定數(shù)據(jù)和各氨基酸分子量，計(jì)算不同氨基酸在茶中的相對(duì)分子數(shù)相加后除總氨基酸含量，得到茶中氨基酸的相對(duì)分子量。

2 結(jié)果與討論

表1為游離氨基酸測(cè)定中2種標(biāo)樣谷氨酸和茶氨酸的吸光值。在相同質(zhì)量下，谷氨酸標(biāo)樣的吸光值高于茶氨酸的吸光值，且隨著標(biāo)樣質(zhì)量的增加這種差異也愈大，從標(biāo)樣質(zhì)量為1mg的吸光度差值0.010逐步增大到質(zhì)量為3.5mg的0.080。這不僅驗(yàn)證了前面的推測(cè)，也表明2種標(biāo)樣制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線會(huì)有很大的差異，按谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出的氨基酸含量將低于按茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的計(jì)算數(shù)值。

表1 游離氨基酸測(cè)定谷氨酸和茶氨酸標(biāo)樣的吸光度Table 1 Absorption value of glutamic acid and theanine standard sample

表2～表4分別為3個(gè)實(shí)驗(yàn)室的茶樣、茶苗根和茶苗芽葉中游離氨基酸的測(cè)定結(jié)果。可以看出，每對(duì)測(cè)定中，按谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線算出的數(shù)據(jù)均低于按茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算的數(shù)據(jù)，顯然這是由于谷氨酸吸光值高于茶氨酸所致。統(tǒng)計(jì)分析t檢驗(yàn)表明，無論是商品茶葉、茶苗芽葉還是茶根，2種標(biāo)樣下的測(cè)定結(jié)果之間達(dá)到極顯著水平或顯著水平（如表5所示)，即用谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的游離氨基酸含量極顯著或顯著低于用茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得的氨基酸含量，以谷氨酸為標(biāo)樣的氨基酸占以茶氨酸為標(biāo)樣氨基酸的70%～94%。

表2 按2種標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算的各樣品中游離氨基酸含量（mg/mL)Table 2 Free amino acid contents in samples calculated by the 2 standard curves（mg/mL)

表3 按文獻(xiàn)[4]測(cè)定的茶樣游離氨基酸含量（%)Table 3 Free amino acid contents in tea samples in literature[4]（%)

表4 按文獻(xiàn)[5]測(cè)定的茶樣游離氨基酸含量（mg/mL)Table 4 Free amino acid contents in tea samples in literature[5]（mg/mL)

對(duì)表1～表4中4組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)成對(duì)比較、分析，如表5所示，在表1組成標(biāo)準(zhǔn)曲線的6個(gè)點(diǎn)中，谷氨酸標(biāo)樣的吸光值比茶氨酸標(biāo)樣平均高出0.057，其差異超過0.01水平，由此斷定按照這樣2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的樣品游離氨基酸含量也將出現(xiàn)極顯著差異，即谷氨酸標(biāo)樣測(cè)定結(jié)果明顯低于茶氨酸標(biāo)樣。正如表5所示，本實(shí)驗(yàn)對(duì)綠茶、紅茶以及茶苗根和芽葉的測(cè)定、劉曉霞對(duì)茶樣的測(cè)定、Chen對(duì)茶樣的測(cè)定皆表明，以谷氨酸作標(biāo)樣的氨基酸含量普遍低于以茶氨酸為標(biāo)樣的含量，差異達(dá)到極顯著或顯著水平。樣品中氨基酸含量越高，差異越大。

表5 表1～表4成對(duì)數(shù)據(jù)的t檢驗(yàn)Table 5 t-test to figures in pair from table 1 to table 4

表6為中茶所對(duì)特級(jí)紅茶祁門紅茶中氨基酸的檢測(cè)結(jié)果（其余2份一級(jí)紅茶數(shù)據(jù)略)?？梢钥闯?，茶葉中各種氨基酸混合存在，以茶氨酸含量最高，質(zhì)量分?jǐn)?shù)占總含量的54.4%，相對(duì)分子數(shù)占總氨基酸分子數(shù)的46.2%，可見用茶氨酸作為茶中游離氨基酸測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)樣品有一定的道理。也正因?yàn)槿绱?，國?biāo)規(guī)定了茶中游離氨基酸含量的測(cè)定可以用此二種中任意一種作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。然而，如表7所示，通過計(jì)算發(fā)現(xiàn)，盡管3份茶葉中測(cè)出的22種游離氨基酸（蛋氨酸痕量檢出)在茶葉中的比例不同，3份茶葉的相對(duì)平均分子量卻很接近，為147～150u，與谷氨酸的分子量147.1u非?？拷?，而離茶氨酸的分子量174.2u相距較遠(yuǎn)。

3 結(jié)論

在茶的游離氨基酸測(cè)定中，谷氨酸和茶氨酸的吸光度差異很大，達(dá)到極顯著水平，是不同標(biāo)樣下樣品中游離氨基酸含量測(cè)定結(jié)果不一致的主要原因，各實(shí)驗(yàn)室用谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定的氨基酸含量普遍低于用茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定結(jié)果[3-5]。

表6 中茶所測(cè)定茶中各類氨基酸含量Table 6 Amino acids in tea samples assayed by Tea Research Institute

表7 茶葉中混合游離氨基酸平均分子量Table 7 Average weight of free amino acids molecular in tea

谷氨酸是各類植物樣品測(cè)定游離氨基酸普遍選用的標(biāo)準(zhǔn)樣品。茶中游離氨基酸有26種[1]，各種氨基酸所占比例不同，低的痕量存在，高的如茶氨酸占整個(gè)游離氨基酸含量50%以上。茶葉中混合氨基酸的平均分子量為147～150u左右，接近谷氨酸分子量147.1u，距離茶氨酸分子量174.2u較遠(yuǎn)，所以應(yīng)該選擇谷氨酸作為茶中游離氨基酸測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)樣品。此外，由于谷氨酸吸光度較大，提高了測(cè)定的靈敏性;茶氨酸分子量較大，吸光度較小，使得標(biāo)準(zhǔn)曲線的上限下降，測(cè)定范圍縮小。遇到氨基酸含量較高的樣品時(shí)，樣品吸光度很容易超過標(biāo)樣最大值，給測(cè)定帶來麻煩。測(cè)定中還發(fā)現(xiàn)，茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)總是略低于谷氨酸的相關(guān)系數(shù)（數(shù)據(jù)略)。顯然，在測(cè)定茶中游離氨基酸時(shí)選擇谷氨酸做標(biāo)樣更加合適。

目前我國茶葉中游離氨基酸總量的測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)是2002年頒布的，距今已有近10年的時(shí)間。隨著我國茶葉理論、生產(chǎn)和銷售的向前發(fā)展，迫切需要提升茶葉功能物質(zhì)的檢測(cè)方法。茶葉游離氨基酸檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)樣品使用谷氨酸比茶氨酸具有較多的優(yōu)點(diǎn)，不僅更加科學(xué)、合理，而且價(jià)格更低，應(yīng)用更普遍，容易購買。

[1]宛曉春.茶葉生物化學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2003.

[2]中共和華人民國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局，中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).GB/T 8314-2002茶游離氨基酸總量測(cè)定[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2002.

[3]周國蘭，何萍，鄭文莉.茚三酮比色法測(cè)定茶葉中游離氨基酸總量方法存在問題的探討[J].化學(xué)分析計(jì)量，2009，18（5)：79-81.

[4]劉曉霞，周國蘭，何萍，等.茶葉游離氨基酸及其總量的國標(biāo)法測(cè)定探討[J].貴州茶葉，2008，36（1)：13-17.

[5]Chen Lin，Chen Qi，Zhang Zhengzhu，et al.A novel colorimetric determination of free amino acids content in tea infusions with 2，4-dinitrofluorobenzene[J].Journal of Food Composition and Analysis，2009，22（2)：137-141.

Choice of standard sample in determination of free amino acids content in tea

MA Xue-long1，ZOU Peng-fei1，WANG Dang-qiang1，CAO Shun-li2，F(xiàn)ANG Jiang-yu1，3，*，WANG Chang3
（1.College of Life and Environmental Sciences，Huangshan University，Huangshan 245041，China;2.Key Laboratory of Tea Biochemistry and Biotechnology of Ministry of Agriculture，Anhui Agricultural University，Hefei 230036，China;3.Huangshan Sino Bio Technology Co.，Ltd.，Huangshan 245900，China)

The stipulation by the national standard that both glutamic acid and theanine can be used as the standard sample in determination of free amino acids in tea is blamed for the difference of this index.By paired-comparison t-test statistics，data of glutamate and theanine absorbances，amino acid contents by glutamic and theanine standards and in literatures were paired one to one，and the variance from the average difference of each sample were analyzed.The result showed that glutamic acid absorbance was very significantly higher than that of theanine，and the difference between the two increased with the increased the amount of the amino acids.Free amino acids content in all samples was lower by glutamic acid standard than by theanine standard，this difference reached significant level.Based on the portion and molecular weight of each amino acid，the average molecular weight of the mixture of the amino acids in tea was calculated as 147～150u，close to the molecular weight 147.1u of glutamic acid but far from the weight 174.2u of theanine. Furthermore，the lower absorbance of glutamic acid made the measurement more insensive.Therefore，it is suggested that the national standard for determination of free amino acids in tea retain glutamic acid and cancel theanine as standard sample.

tea;amino acids;national standard;standard sample;glutamic acid

TS272.7

A

1002-0306（2012)16-0061-04

2011－12－23 *通訊聯(lián)系人

馬雪瀧（1963-)，男，副教授，研究方向：生物技術(shù)。

國家自然基金項(xiàng)目（30771755);黃山學(xué)院引進(jìn)博士啟動(dòng)資助項(xiàng)目（2012xkjq003);黃山市科技孵化資金項(xiàng)目（2010F-03);黃山學(xué)院大學(xué)生科研項(xiàng)目（2011xdkj043，2011xdkj056)。