基于表面增強拉曼光譜的塑料增塑劑鄰苯二甲酸酯定性篩查技術研究

紀麗君，謝云飛，姚衛(wèi)蓉

(食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學食品學院，江蘇無錫214122)

基于表面增強拉曼光譜的塑料增塑劑鄰苯二甲酸酯定性篩查技術研究

紀麗君，謝云飛，姚衛(wèi)蓉*

(食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學食品學院，江蘇無錫214122)

為建立食品中鄰苯二甲酸酯(PAEs)類物質的快速篩查技術，本文首先以最受關注的6種PAEs(包括DEHP、DBP、BBP、DINP、DIDP和DNOP)為研究對象，研究了PAEs的拉曼光譜圖，得到8個特征峰，并以DEHP為例，采用密度泛函理論(DFT)B3LYP方法，在6-311G(d)基組水平上進行了構型優(yōu)化和頻率分析，對8個特征峰的分子振動模式進行了詳細的歸屬指認。同時，研究了0.1mg/kg DEHP二氯甲烷溶液和三種PAEs物質混合液的表面增強拉曼光譜(SERS)，并將SERS應用于牛奶實際樣品中痕量PAEs的快速篩查，經氣相-質譜聯(lián)用(GC-MS)方法驗證結果。結果顯示，SERS技術能快速篩查出牛奶樣品中痕量PAEs物質，GC-MS驗證表明具有很好的準確性，SERS在PAEs的快速定性篩查中具有很好的應用潛力。

鄰苯二甲酸酯，鄰苯二甲酸-2-乙基己基酯(DEHP)，表面增強拉曼光譜(SERS)，密度泛函理論(DFT)，定性分析

Abstract:Based on surface-enhanced Raman scattering(SERS)，a rapid qualitative analysis method of plastic stabilizer phthalates(PAEs)was established.By analyzing Raman spectra of DEHP，DBP，BBP，DINP，DIDP and DNOP，8 characteristic peaks were figured out，which was further confirmed by theoretical calculation of di-2-ethyl hexyl phthalate(DEHP)by density functional theory(DFT)-the B3LYP method and the 6-311G(d)basis sets.Surface-enhanced Raman scattering(SERS)spectroscopy was realized by Au-nanosubstrate.In addition，qualitative analysis of trace PAEs in milk was performed，and the result was validated by gas chromatographymass spectrometry(GC-MS).The results demonstrated that SERS technology could be developed as a rapid method for screening of trace PAEs in food samples.

Key words:phthalates;DEHP;surface enhancement Raman spectroscopy(SERS);density functional theory(DFT);qualitative analysis

鄰苯二甲酸酯(phthalic acid esters，PAEs)類物質具有類雌激素毒性，可通過空氣、水、食物三大途徑進入人體，對人體產生內分泌干擾作用。近年來應用非常廣泛，最主要的一個用途是作為塑料合成的增塑劑。據世界衛(wèi)生組織(WHO)估計PAEs的年產量為800萬t，其中鄰苯二甲酸(2-乙基已基)酯(DEHP)占50%，每年約有1.8%的DEHP泄露進入環(huán)境［1］。研究表明含有PAEs的塑料材料(如聚氯乙烯、聚丙烯等)常與食品直接接觸，加上復雜的食品加工、存儲和運輸過程，PAEs會發(fā)生遷移進入食品［2-5］。此外，還有摻偽問題，如2011年，媒體揭露臺灣某企業(yè)將DEHP作為乳化劑摻入飲料的“增塑劑風波”。歐盟于2007年正式實行的2005/84/EC號指令關注的PAEs是鄰苯二甲酸-2-乙基己基酯(DEHP)、鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)、鄰苯二甲酸丁基芐酯(BBP)、鄰苯二甲酸二異壬酯(DINP)、鄰苯二甲酸二異癸酯(DIDP)、鄰苯二甲酸二辛酯(DNOP)等6種［6］。美國消費品安全改進法案(CPSIA)第108條對這6種PAEs有限量標準，要求兒童玩具或兒童護理用品中這6類鄰苯二甲酸酯的含量都不得超過0.1%［7］。目前，PAEs的主要檢測方法為氣相-質譜聯(lián)用(GC-MS)［2］、氣相色譜- 火焰離子化檢測器(GC-FID)［3，8］、高效液相(HPLC)［2，9-10］等方法，這些方法復雜且耗時。利用表面增強拉曼光譜(Surfaceenhanced Raman scattering，SERS)快速檢測和在線篩查食品中污染物、實時監(jiān)測食品運輸或發(fā)酵過程等方面的研究在近年來成為一個新的探索方向。已經有研究將SERS應用于食物中三聚氰胺［11］、多環(huán)芳烴［12］等物質的檢測。關于PAEs的拉曼光譜僅有少量研究。Norbygaard等［13］用傅立葉變換拉曼光譜研究了環(huán)境中常見的22種PAEs的6個共同特征峰，但其未對這些特征峰做進一步的歸屬研究。Nyquist等［14］假設 PAEs 分子為 C2v點群(具有 C2v對稱性，即一個對稱軸和兩個相互垂直對稱面)，根據鄰二氯苯分子的振動模型討論了PAEs分子振動方式并進行了歸屬指認，但是，并沒有模擬PAEs分子的化學模型，然而，PAEs分子中存在兩個羧基，具有空間位阻，并不像鄰二氯苯那樣具有C2v對稱性。本文對PAEs進行拉曼光譜特征研究，并結合量子化學理論進行計算，指認特征峰;將基于SERS的快速定性檢測技術應用于牛奶實際樣品，期望能應用于快速篩查大批量食品或實時在線監(jiān)測食品生產和運輸過程中的DEHP污染物，為食品安全檢測提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)、鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)、鄰苯二甲酸(2-乙基已基)酯(DEHP)、鄰苯二甲酸二正辛酯(DNOP) 國藥集團化學試劑有限公司，氣相色譜固定液，純度≥99.0%;鄰苯二甲酸丁基芐基酯(BBP) 東京化成工業(yè)株式會社(TCI)，純度＞98.0%;鄰苯二甲酸二異壬酯(DINP)、鄰苯二甲酸二異癸酯(DIDP) Sigma Aldrich公司，純度≥99.0%;二氯甲烷(CH2Cl2)、乙酸乙酯 國藥集團化學試劑有限公司，分析純;乙腈 美國TEDIA公司，色譜純;超純水。

KlariteTM-SERS金納米增強基底 英國Renishaw Diagnostics公司，硅表面刻蝕周期性排列的倒金字塔形狀的有序結構后，鍍一層100nm的金納米顆粒，基底大小為6mm×10m，4mm×4mm的活性區(qū)域上刻蝕1.8μm開口的倒金字塔形洞，有研究表明在倒金字塔的底部區(qū)域存在4個電磁場較強的區(qū)域，為熱點區(qū)域;便攜拉曼儀RamTracer?-200-WF-B 美國歐普圖斯科技公司，激光光源波長785nm，輸出激光功率在0～340mW之間可調，配備液態(tài)樣品池，光譜范圍100～3300cm-1;Renishaw Iniva共聚焦顯微拉曼儀 英國Renishaw公司，配備科研級光學顯微鏡，測量參數選用×50倍物鏡、785nm波長的激光光源、功率衰減1%，光譜分辨率為1cm-1;PolarisQ型氣相色譜-質譜聯(lián)用儀 配有AS3000自動進樣器，美國Thermo Finnigan公司;1g/6mL LC-C18固相萃取玻璃小柱 德國CNW公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 PAEs拉曼光譜采集與特征峰分析 分別取500μL DEP、DBP、DEHP、DnOP、BBP、DIDP 和 DINP標準品，置于拉曼小瓶中，放入便攜拉曼儀RamTracer的液態(tài)樣品池中，采用785nm激光波長，100mW功率，掃描范圍100～3300cm-1，掃描時間1s，掃描3次求平均的掃描條件，依次掃描DEP、DBP、DEHP、DnOP、BBP、DIDP 和 DINP的普通拉曼光譜。比較分析這6種PAEs的普通拉曼光譜，確定鄰苯二甲酸酯類化學物質的共同特征峰，作為PAEs的定性峰。采用 Gaussian 03［15］軟件密度泛函理論，B3LYP泛函和6-311G(d)基組，選擇鄰苯二甲酸酯類中使用量最大、各國食品安全規(guī)則最關注的DEHP為研究對象，建立化學模型，對構型優(yōu)化和拉曼振動光譜進行模擬計算。對比實驗拉曼光譜和理論拉曼光譜，對主要特征峰的振動方式進行詳細的歸屬指認。

1.2.2 PAEs混合溶液的配制 將 DMP、BBP和DEHP配制成 0.1mg/kg PAEs混合溶液;并將0.1mg/kg DMP、BBP和 DEHP的二氯甲烷溶液以2∶3∶4(體積比)比例混合配成三種PAEs物質的混合液，PAEs混合液中DMP、BBP和DEHP的摩爾量比約為 1∶1∶1。

1.2.3 掃描PAEs樣品SERS 分別對0.1mg/kg DEHP和0.1mg/kg的PAEs混合溶液進行SERS掃描。取20μL樣液滴于Klarite金納米增強基底，自然蒸干。用共聚焦顯微拉曼儀掃描干斑，激光源波長785nm，功率衰減為1%。

1.2.4 牛奶樣品的預處理 牛奶中提取鄰苯二甲酸酯類的方法是按照文獻［16］中的前處理方法稍加修改而得的，將過6mL C18固相萃取小柱的流出液等分為兩份。實驗過程中，為避免容器污染，使用牛奶本來的利樂磚包裝盛放樣品［1］，使用不銹鋼或玻璃材質的離心管和燒杯。對需使用的各種玻璃、不銹鋼儀器用二氯甲烷潤洗后，在馬弗爐里200℃烘2h，以確保測定結果不受干擾。

1.2.5 掃描牛奶樣品SERS 取其中一份流出液在水溫為60℃條件下氮氣吹干，用二氯甲烷定容至0.5mL，取20μL滴在金納米增強基底上，自然蒸干。用共聚焦顯微拉曼儀掃描干斑，掃描條件同1.2.3。

1.2.6 牛奶樣品GC-MS分析 取另一份流出液在水溫為 60℃條件下氮氣吹至 0.5mL，濃縮液過0.45μm一次性微孔濾膜，濾液注入 GC-MS進行分析。

2 結果與討論

2.1 PAEs的拉曼光譜

PAEs有二十多種，目前，DEHP、DBP、BBP、DINP、DIDP和DNOP為歐盟和美國的法規(guī)標準中最受關注的6種PAEs，是食品、玩具、化妝品中的主要監(jiān)控對象。圖1是測得的6種常見PAEs——DEHP、DBP、BBP、DINP、DIDP 和 DNOP 標準品的普通拉曼光譜，容易發(fā)現(xiàn)鄰苯二甲酸酯類物質具有的共同特征峰 為 403、653、1043、1127、1167、1585、1605、1731cm-1等8個。通過研究拉曼光譜，這8個特征峰主要是源自PAEs的兩個特征基團——酯基和鄰苯基團的分子振動。

用Gaussian 03軟件采用密度泛函理論(DFT)B3LYP方法，在6-311G(d)基組水平上對DEHP建立分子模型進行化學模擬，進行構型優(yōu)化和分子振

表1 DEHP拉曼光譜主要特征峰的振動模式歸屬Table 1 Assignment of vibration modes to the main characteristic bands of DEHP

圖1 6種常見PAEs的拉曼光譜圖Fig.1 Raman spectra of six common PAEs

拉曼光譜，DNOP的譜線經過Origin軟件拉基線處理。動頻率分析。由于空間位阻效應，DEHP分子的酯基中C=O與苯環(huán)不共面，先前研究在對PAEs中最簡單的分子DMP進行構型優(yōu)化時，得出兩個C=O與苯環(huán)的夾角分別為133.78°和-24.00°，以此夾角為DEHP的初始結構，編寫Gaussian 03構型優(yōu)化的輸入文件，得到收斂的構型后，計算得其理論拉曼光譜，結果如圖2(a)所示。對比DEHP理論光譜與實驗光譜，以1585cm-1和1605cm-1兩個特征峰為準，得出兩條光譜的校正系數0.9708。理論光譜經過較正之后，與實驗光譜在峰位上達到了較高的一致性。由于實驗中檢測器對光譜高波數響應弱［17］，相較于理論光譜信號，實驗光譜在高波數處的振動峰強度較低。

用GaussViews 5.0對DEHP的拉曼光譜計算結果進行分析，參考文獻［14］和［18］，對其拉曼光譜主要特征峰的振動模式進行了指認。如表1所示。

2.2 PAEs的SERS分析

利用商業(yè)化的大面積有序金納米增強基底分別對0.1mg/kg DEHP二氯甲烷溶液和PAEs混合液進行SERS掃描。作為PAEs的溶劑的二氯甲烷易揮發(fā)，可縮短實驗時間，同時揮發(fā)速度又不至太快，可以與金基底材料表面的有序結構實現(xiàn)充分的接觸，從而將待測物質帶入倒金字塔格子的熱點部位，得到良好的譜峰增強效果。實驗結果如圖3所示。在金納米基底上，0.1mg/kg DEHP二氯甲烷溶液和PAEs混合液都得了表面增強拉曼光譜，8個主要特征峰均得以增強。

圖2 DEHP的理論與實驗拉曼光譜對比Fig.2 Comparison of theoretical and experimental Raman spectra of DEHP

圖3 0.1mg/kg DEHP和PAEs混合液的增強拉曼光譜Fig.3 Surface-enhanced Raman spectra of 0.1mg/kg DEHP and mixed PAEs

2.3 牛奶中痕量PAEs的定性篩查

意在將SERS方法應用于實際樣品的檢測。隨機選取了3種不同品牌的牛奶，經過前處理后，提取液滴在金基底上的拉曼光譜均具有PAEs的8個特征峰，如圖4。與圖3中PAEs溶液的SERS圖相比，牛奶提取液的SERS圖有幾處不同。第一，1044cm-1峰前面的1004cm-1處有個很強的拉曼峰，在圖3中也有這樣一個拉曼峰(強度弱于1044cm-1峰)，推測原因可能是牛奶復雜基質中含有某種物質在1004cm-1處有拉曼峰;第二，656cm-1特征峰前面出現(xiàn)了一個寬峰。除此之外，PAEs的8個特征峰都存在，表明3種牛奶中均含有PAEs。通過GC-MS的檢測，這3種牛奶樣品中DEHP的含量分別為1.70、1.64、0.67mg/kg，證明了SERS方法在檢測這3種牛奶中的PAEs是可行的。

圖4 3種牛奶中痕量PAEs的SERS光譜Fig.4 Surface-enhanced Raman spectra of trace PAEs in three bands of milk

3 結論

本文利用拉曼方法對6種常見的PAEs進行檢測，利用密度泛函方法得出的理論拉曼光譜與實際實驗測得光譜進行了比較。并利用金納米基底實現(xiàn)對痕量PAEs的定性SERS檢測，進一步將SERS技術應用于實際牛奶樣品中PAEs的檢測，并取得了較好效果。證明了SERS快速檢測技術可以用于定性篩查含痕量PAEs污染物的牛奶樣品。

SERS技術是集物理吸附、化學模擬、納米材料合成為一體的跨學科技術。便攜拉曼儀器的快速發(fā)展，大大推動了SERS技術在實際樣品檢測中的應用發(fā)展。然而，真正將SERS技術應用于實際生產還需要進一步的研究，急需開發(fā)重復性好、成本低的SERS基底，實現(xiàn)在線快速檢測食品藥品中痕量PAEs污染物的目的。

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Rapid analysis of plastic stabilizer phthalates by surface enhancement Raman spectroscopy

JI Li-jun，XIE Yun-fei，YAO Wei-rong*
(State Key Laboratory of Food Science and Technology，School of Food Science ＆ Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

TS207

A

1002-0306(2012)15-0297-04

2012-02-17 *通訊聯(lián)系人

紀麗君(1986-)，女，碩士在讀，研究方向:食品安全與質量控制。

“十一五”國家科技支撐計劃重點項目(2009BADB9B04)。