野生桑葚中花色苷成分分析

陳 亮，辛秀蘭，袁其朋

(1.北京化工大學(xué)化工資源有效利用國家重點實驗室，北京100029;2.北京電子科技職業(yè)學(xué)院，北京100029)

野生桑葚中花色苷成分分析

陳 亮1，2，辛秀蘭2，*，袁其朋1，*

(1.北京化工大學(xué)化工資源有效利用國家重點實驗室，北京100029;2.北京電子科技職業(yè)學(xué)院，北京100029)

運用固相萃取純化技術(shù)與高效液相色譜/二極管陣列檢測器/電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，采用Zorbax SB-C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)，甲醇-5%甲酸水溶液為流動相，流速為1.0mL/min，檢測波長為520nm，以矢車菊素3-葡萄糖苷為對照，外標(biāo)法測定了野生桑葚花色苷含量，并通過紫外掃描光譜和電噴霧質(zhì)譜正離子碎片信息確定了花色苷的成分組成。結(jié)果表明:野生桑葚總花色苷含量為154.27mg/100g，含有的三種花色苷成分分別為矢車菊素3-葡萄糖苷、矢車菊素3-蕓香糖苷和天竺葵素3-葡萄糖苷，其相對含量為67.52%、31.29%和1.06%。

野生桑葚，花色苷，固相萃取，高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用

Abstract:To establish a method to determine anthocyanin content and composition in wild mulberry，solid phase extraction(SPE)and high performance liquid chromatography equipped with a DAD detector and electro-spray ionization mass spectrometry(HPLC/DAD/ESI/MS)were used.The analysis was carried on Zorbax SB-C18column(250mm ×4.6mm，5μm).The mobile phase was aqueous 5%formic acid solution and methanol at the flow-rate of 1.0mL/min，the detection wavelength was 520nm.The content of gross anthocyanins was 154.27mg/100g by HPLC expressed as milligrams of cyanidin 3-glucoside equivalent per 100g of fresh weight.Three anthocyanins in wild mulberry were identified by UV-Vis and ESI+-MS spectra which were cyanidin 3-glucoside，cyanidin 3-rutinoside and pelargonidin 3-glucoside，the relative content of which were 67.52%，31.29%，1.06%respectively.

Key words:wild mulberry;anthocyanin;solid phase extraction;high performance liquid chromatography-mass spectrometry(HPLC/MS)

桑葚(Mulberry)是桑科桑屬落葉喬木桑樹Morusalba Linn.的果實，曬干或蒸后曬干可入藥，味甘酸，性寒，歸心、肝、腎經(jīng)，中醫(yī)可用于治療肝腎不足和血虛精虧導(dǎo)致的頭暈?zāi)垦?、腰酸耳鳴、失眠多夢、津傷口渴等癥。桑葚酸甜適口，營養(yǎng)豐富，富含鞣酸、蘋果酸、多種維生素和人體必需的氨基酸及鋅、鉀、鎂、磷等微量礦質(zhì)元素，具有良好的保健功能，很早就被當(dāng)作水果和中藥材加以應(yīng)用［1］。此外，桑葚顏色紫紅，含有大量的天然紅色素。桑葚紅色素屬花色苷類成分，是果蔬及其產(chǎn)品呈現(xiàn)從紅色到藍(lán)色的物質(zhì)基礎(chǔ)，具有抑制血小板凝固，預(yù)防血栓、心臟病，抗癌，延緩衰老等作用［2-4］。桑葚中的紅色素含量高、色度高、性質(zhì)穩(wěn)定、安全無毒，是從自然界中提取花色苷的主要來源之一?；袅樟盏扔弥苯臃止夤舛确ê蚿H示差分光光度法兩種方法分別測定了桑葚果汁中總花色苷含量，表明這兩種方法用于總花色苷的測定都具有良好的線性相關(guān)性，且直接分光光度法操作簡便，結(jié)果更準(zhǔn)確［5］。Q.Du等用高速逆流色譜(HSCCC)分離純化鑒定出杭州產(chǎn)桑葚中花色苷成分為矢車菊素3-O-(6-O-鼠李糖-葡萄糖苷)(C3RG)、矢車菊素 3-O-(6″-O-鼠李糖-半乳糖苷)(C3RGa)、矢車菊素3-葡萄糖苷(C3G)、矢車菊素3-O-半乳糖苷(C3Ga)和矢車菊素7-葡萄糖苷(C7G)等五種花色苷成分［6］。但是，分光光度法分析測定花色苷過于籠統(tǒng)、簡單，不能得到桑葚花色苷單個成分的分析結(jié)果，另一方面，先分離純化，再用質(zhì)譜、核磁等手段鑒定費時費力，不能快速得到花色苷的鑒定結(jié)果，甚至丟失部分含量較少的花色苷成分。因此，本實驗通過高效液相色譜與光電二極管陣列檢測器和電噴霧質(zhì)譜檢測器聯(lián)用技術(shù)(HPLC-DAD-ESI-MS)，既可以通過色譜圖的總峰面積測得桑葚中花色苷的含量，又能得到花色苷類物質(zhì)的紫外光譜信息、分子量和分子結(jié)構(gòu)的碎片信息，鑒定桑葚中花色苷的成分，為今后桑葚花色苷的研究提供了一種快速準(zhǔn)確且簡便易行的檢測方法［8］。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

野生桑葚冷凍果 采自安徽;對照品矢車菊素3-葡萄糖苷(純度＞98%) 購自成都曼思特生物科技有限公司;甲醇、甲酸 均為色譜純;鹽酸 分析純;水 重蒸水。

LC-DAD-ESI-MS 1200/6120高效液相色譜-二極管陣列檢測器-電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用儀 Agilent公司;C9860A超聲波清洗器 CBL公司;Laborota 4000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 Heidolph公司;12孔固相萃取真空操作系統(tǒng) Grace公司;Bond Elut-C18，500mg 3mL，50/PK固相萃取小柱 Varian公司。

1.2 野生桑葚花色苷的提取

花色苷為水溶性色素，易溶于甲醇、乙醇、丙酮等溶劑，在pH＞5的溶液中不穩(wěn)定，酸性條件有利于提高花色苷的穩(wěn)定性，因此，在甲醇、乙醇等提取溶劑中常加入鹽酸、酒石酸、檸檬酸等酸化試劑，以防止花色苷的降解，本實驗采用0.1%鹽酸甲醇溶液對桑葚中的花色苷進行提取。分別稱取10g樣品，解凍搗碎，溶于100mL 0.1%鹽酸甲醇溶液中，靜置過夜，過濾，濾渣再另加100mL提取溶劑，振蕩浸提三次，過濾，洗滌濾渣至無色，合并3次上清液，40℃減壓濃縮，殘渣用0.1%鹽酸水溶液定容至25mL。

1.3 野生桑葚花色苷的純化

Bond Elut-C18固相萃取小柱先分別用2mL 0.1%鹽酸甲醇溶液和2mL 0.1%鹽酸水溶液清洗活化，然后加入2mL花色苷提取液，抽真空至液體緩慢流盡，再用10mL 0.1%鹽酸水溶液清洗柱子，棄掉洗脫水溶液，最后用2mL 0.1%鹽酸甲醇溶液洗脫，收集甲醇洗脫液。將收集的甲醇洗脫液40℃真空旋蒸至干，用2mL 0.1%鹽酸甲醇溶液溶解，以備液質(zhì)測定。

1.4 液相色譜和質(zhì)譜條件

液相色譜條件:Zorbax C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm);流動相:A液為甲醇，B液為5%的甲酸水溶液，線性梯度洗脫:0～10min，A液從5%升至20%，保持5min;15～30min，A液從20%升至25%，保持 5min;35～50min，A液從 25%升至 33%;50～60min，A 液從33%升至45%;流速:1mL/min;柱溫30℃;進樣量10μL;檢測波長:520nm;DAD檢測器，200～600nm全掃描。

質(zhì)譜條件:正離子掃描(ESI+，m/z 200～1200)，碰撞誘導(dǎo)解離電壓:150V;毛細(xì)管電壓:3.8kV;錐孔電壓:30V;光電倍增器電壓:650V;離子源溫度:120℃;脫溶劑氣溫度:250℃。

1.5 對照品溶液的配制及線性關(guān)系考察

精確稱取對照品矢車菊素3-葡萄糖苷5mg溶于 10mL 0.1% 鹽酸甲醇溶液，進樣 0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0μL，液相色譜及紫外檢測條件見1.4，各重復(fù)進樣三次，計算三次平均峰面積。將紫外檢測峰面積Y與溶液濃度X進行一元線性回歸分析，對照品矢車菊素3-葡萄糖苷在0.25～8.0μg范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=2233X+13.38，相關(guān)系數(shù)R2=0.9999。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑葚花色苷提取液含量測定

固相萃取(SPE)是一種快速、簡單、可靠的純化方法，可以有效地除去提取液中糖、酸、蛋白質(zhì)、果膠等雜質(zhì)，便于提取物中有效成分的分析檢測。本文采用以C18鍵合的硅膠為填料的固相萃取柱對花色苷純化，來消除質(zhì)譜離子源的污染，對花色苷進行便捷的分析檢測［9-11］。

花色苷的含量測定主要有分光光度法和HPLC法兩種方法，分光光度法又分為直接測定法和pH示差法，直接測定法能夠快速簡單測定花色苷的含量，但是，由于花色苷褐變產(chǎn)生的多聚降解產(chǎn)物導(dǎo)致花色苷測量值偏高，而pH示差法可以有效地消除降解產(chǎn)物的干擾，被眾多學(xué)術(shù)、政府和工業(yè)實驗室推薦為官方第一測定方案(First Action Official Method)［12］。盡管如此，HPLC方法測定總花色苷有pH示差法不可比擬的優(yōu)勢，圖1為桑葚花色苷提取物以520nm為檢測波長時的高效液相色譜圖，從色譜圖中既可以通過保留時間的差異看出桑葚花色苷提取物中含有三種不同的花色苷，又可以對各色譜峰面積進行相加，通過對照品線性回歸方程的計算得出，桑葚中總花色苷的含量為154.27mg/100g。

圖1 桑葚花色苷提取物(A)和矢車菊3-葡萄糖苷(B)的高效液相色譜圖(檢測波長520nm)Fig.1 HPLC chromatograms of mulberry anthocyanin extract(A)and cyanidin 3-glucoside(B)(detected at 520nm)

2.2 桑葚花色苷提取液的液相色譜和紫外光譜

20世紀(jì)50年代，紫外-可見光譜就被人們應(yīng)用于花色苷的結(jié)構(gòu)鑒定。在甲醇溶液中，大多數(shù)黃酮類成分(如黃酮、黃酮醇、黃烷酮、二氫黃酮等)的紫外吸收光譜有兩個主要吸收帶，由桂皮?；到y(tǒng)的電子躍遷引起的吸收帶(300～400nm)和由苯甲?；到y(tǒng)的電子躍遷引起的吸收帶(240～280nm)組成，而花色苷是黃酮類成分，其在280nm和520nm左右的兩個波長處有特征吸收峰，尤其在520nm左右，除了花色苷，其他成分極少在此有強吸收峰，因此，圖1中三個色譜峰的紫外-可見光譜最大吸收都有在500～550nm處(見圖2)，可以確定它們都為花色苷類成分。

圖2 色譜峰1、峰2和峰3的紫外可見吸收光譜圖Fig.2 UV-Vis spectra of peaks 1，peak 2 and peak 3

表1 桑葚花色苷提取物的液相色譜和光譜特性Table 1 Liquid chromatographic and spectral characteristics of anthocyanins from mulberry

此外，花色苷的紫外吸收光譜還可確定花色苷元及糖基取代種類及位置?；ㄉ盏淖贤饪梢娢展庾V在紫外光區(qū)有相似的吸收，但是在可見光區(qū)的吸收差異較為明顯。紫外吸收光譜測定值可以確定糖苷在花色素分子上的連接位置，花色苷分子中C3羥基總是糖基化的，此外糖基化也可發(fā)生在C5、C7、C3＇、C5＇的羥基。花色素分子糖基化后，可見光區(qū)譜圖最大特征吸收波長(λmax)向短波方向移動(即藍(lán)移)。這種藍(lán)移效應(yīng)取決于糖基化羥基的數(shù)目和位置。最大的藍(lán)移效應(yīng)發(fā)生在花色素的C3引入糖苷。天竺葵色素、矢車菊素、飛燕草素在C3引入糖苷，藍(lán)移波長都在 10nm以上，如:天竺葵色素 λmax是520nm，它的C3糖苷為505nm;其在C5引入糖苷，藍(lán)移波長約為7nm。C3和C5糖基化與C3糖基化在光譜最大特征吸收處得差異較小。據(jù)J.B.Harborne的測算，花色苷C3和C5雙糖糖基化的A440/AλVis-max值是C3單糖糖基化的一半，因此，根據(jù)A440與AλVis-max的比值并結(jié)合J.B.Harborne的計算值可以判斷糖基化的位置［13］。由表1可知，三種花色苷的A440/AλVis-max值都在30及以上，表明糖取代基處在花色苷的C3的羥基上。三個色譜峰在300～330nm處都沒有明顯的吸收峰存在，說明花色苷分子沒有發(fā)生酰化，此外，矢車菊苷A440/AλVis-max的平均值在30左右，而天竺葵色素苷 A440/AλVis-max在40左右［8］，可以初步確定峰1和峰2為矢車菊素單糖苷，而峰3為天竺葵色素單糖苷。

2.3 花色苷的質(zhì)譜分析

液質(zhì)的單級四極桿質(zhì)譜檢測器決定了質(zhì)譜圖只能得到一級質(zhì)譜圖(或分子離子峰譜圖)，但可以通過調(diào)節(jié)碰撞誘導(dǎo)解離電壓值，在離子源內(nèi)將部分分子離子峰打碎，對碎片離子進行分析推斷得到化合物的結(jié)構(gòu)，故本實驗在70V和200V電壓范圍內(nèi)優(yōu)化了質(zhì)譜的碰撞誘導(dǎo)解離電壓，在低電壓下，質(zhì)譜圖僅能得到花色苷分子離子譜圖，在高電壓下，只有碎片離子峰譜圖，都難以分析組分的結(jié)構(gòu)和分子量，而在150V條件下，譜圖中既可得到分子離子峰和強度適中的花色苷元碎片離子，便于分析推斷花色苷的結(jié)構(gòu)。

圖3 桑葚花色苷(峰1、峰2和峰3)ESI+質(zhì)譜圖Fig.3 ESI+-MS spectra of mulberry anthocyanins(Peak 1，Peak 2 and Peak 3)

由峰1的質(zhì)譜圖可知，其分子離子［M+H］+為m/z 449.1，碎片離子為 m/z 287.0，是由分子離子丟失了一個162葡萄糖的中性碎片而得。由于對照品矢車菊素3-葡萄糖苷的保留時間與峰1的保留時間一致，因此，峰1所代表的花色苷是葡萄糖和矢車菊形成的苷。確定峰1為矢車菊3-葡萄糖苷。

由峰2的質(zhì)譜圖可知，其分子離子［M+H］+為m/z 596.5，碎片離子為m/z 287，分子離子丟失一個蕓香糖的中性碎片即為矢車菊素的碎片離子，故推斷峰4為矢車菊素3-蕓香糖苷，矢車菊3-葡萄糖苷和矢車菊素3-蕓香糖苷是桑葚含有的最普遍、含量最高的花色苷，與文獻報道的結(jié)果一致［6］。

由峰3的質(zhì)譜圖可知，其分子離子［M+H］+為m/z 433.1，碎片離子為m/z 271，分子離子丟失一個葡萄糖的中性碎片即為天竺葵色素的碎片離子，結(jié)合光譜及文獻數(shù)據(jù)［14］，故推斷峰3為天竺葵素3-葡萄糖苷。

圖4 野生桑葚中花色苷成分的結(jié)構(gòu)圖Fig.4 Structure of mulberry anthocyanins

3 結(jié)論

采用固相萃取純化技術(shù)和高效液相色譜-電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)可以方便、快捷、可靠地分析桑葚中花色苷的含量和成分。結(jié)果表明，野生桑葚中總花色苷含量為154.27mg/100g，含有的花色苷為矢車菊3-葡萄糖苷、矢車菊3-蕓香糖糖苷、天竺葵素3-葡萄糖苷，相對含量分別為67.52%、31.29%和1.06%。

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Analysis of compositions of anthocyanins in wild mulberry

CHEN Liang1，2，XIN Xiu-lan2，*，YUAN Qi-peng1，*
(1.State Key Laboratory of Chemical Resource Engineering，Beijing University of Chemical Technology，Beijing 100029，China;2.Beijing Electronic Science and Technology Vocational College，Beijing 100029，China)

TS255.1

A

1002-0306(2012)15-0307-04

2011-12-05 *通訊聯(lián)系人

陳亮(1986-)，男，博士生，主要從事天然產(chǎn)物的分離純化研究。

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201103037);北京市屬高等學(xué)校人才強教深化計劃資助項目;北京市職業(yè)院校職教名師資助項目。