響應(yīng)面法優(yōu)化紅花籽粕5-羥色胺衍生物提取工藝

李文聰，楊仁明，強(qiáng) 偉，索有瑞，丁晨旭*

1中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所，西寧 810001;2中國(guó)科學(xué)院研究生院，北京 100049

紅花(Carthamus tinctorius L)菊科屬植物，是一種藥、染料、油、飼料兼用的經(jīng)濟(jì)作物［1］。紅花籽，中藥習(xí)稱“白平子”，是紅花(Carthamus tinctorius L)的種子［1］。紅花籽粕是紅花籽提取油后的廢棄物，國(guó)內(nèi)多用作廉價(jià)的肥料和飼料，對(duì)其中的化學(xué)成分研究較少。近年來(lái)，國(guó)外對(duì)紅花籽粕中的一些微量成分進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)紅花籽粕中的5-羥色胺衍生物具有極強(qiáng)的抗氧化性和清除自由基活性［2］，可以調(diào)節(jié)人體內(nèi)免疫反應(yīng)，抑制腫瘤［3］、保護(hù)人體中的NK細(xì)胞免受程序性死亡［4］、強(qiáng)烈抑制黑色素生成等活性［5］。紅花籽粕中的N-阿魏酰5-羥色胺和N-(p-香豆酰)5-羥色胺具有保護(hù)心臟的功能，可以促進(jìn)心肌運(yùn)動(dòng)，預(yù)防心肌機(jī)能發(fā)生障礙［6］。有的研究還表明，N-(p-香豆酰)5-羥色胺可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖［7］，并且將會(huì)是一種很好的抗炎藥物［8］，對(duì)促進(jìn)人類的健康有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅花籽粕購(gòu)自新疆;5-羥色胺硫酸肌酐標(biāo)準(zhǔn)品(純度99%);甲醇、乙醇和正己烷(均為分析純)。

1.2 儀器與設(shè)備

優(yōu)普UPT系列超純水器，成都超純科技有限公司;ALC-110.4型電子天平，德國(guó)Acculab公司;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，國(guó)華電器有限公司;EYELA N-1100型旋蒸蒸發(fā)儀，上海愛朗儀器有限公司;UV-759紫外-可見分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 5-羥色胺衍生物的提取方法

準(zhǔn)確稱取過(guò)篩后的紅花籽粕5.00 g，加入不同的有機(jī)溶劑回流提取，提取液減壓抽濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，再用體積分?jǐn)?shù)80%甲醇溶解，用正己烷萃取，取80%甲醇相，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)，用甲醇溶解測(cè)定5-羥色胺衍生物含量。

具體的操作流程:紅花籽粕(原料)→過(guò)篩→紅花籽粕粉末→回流提取→減壓抽濾→濾液→蒸干→80%甲醇溶解→正己烷萃取→分液(80%甲醇相)→蒸干→甲醇溶解→5-羥色胺衍生物含量測(cè)定。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作和5-羥色胺衍生物含量測(cè)定［8］

精確稱取5-羥色胺硫酸肌酐標(biāo)準(zhǔn)品0.1 g，0.1 mol/L鹽酸定容至100 mL。精密吸取1 g/L的5-羥色胺硫酸肌酐溶液 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，分別置于10 mL容量瓶中，用0.1 mol/L鹽酸定容。用0.1 mol/L鹽酸做空白，310 nm波長(zhǎng)處測(cè)5個(gè)樣品的吸光度(A)，以5-羥色胺衍生物濃度(C，g/L)為橫坐標(biāo)，吸光度值(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。用最小二乘法計(jì)算得到回歸方程 A=3.1802C+0.0222(R2=0.999)。

5-羥色胺衍生物提取得率/%=(紅花籽粕5-羥色胺衍生物質(zhì)量/紅花籽粕質(zhì)量)×100%

1.5 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.5.1 提取溶劑對(duì)提取得率的影響

準(zhǔn)確稱取5.00 g粉碎度為32目的紅花籽粕粉末5份，分別置于250 mL圓底燒瓶中，液料比20∶1(mL/g)，分別以70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、無(wú)水乙醇、甲醇和乙酸乙酯作為提取溶劑，80℃條件下回流提取2 h。

1.5.2 原料粒度對(duì)提取得率的影響

選取12、20、32、40和60目的紅花籽粕進(jìn)行研究。其他的回流提取條件:無(wú)水乙醇為提取溶劑、回流溫度為80℃、回流提取時(shí)間為2 h、液料比為20∶1，測(cè)定提取得率。

1.5.3 提取時(shí)間對(duì)提取得率的影響

控制回流條件:提取溶劑為無(wú)水乙醇、原料粒度32目、液料比為20∶1、提取溫度為80℃。提取時(shí)間選取0.5、1、1.5、2、2.5、3，考察其對(duì)提取得率的影響。

1.5.4 提取溫度對(duì)提取得率的影響

控制回流條件:提取溶劑為無(wú)水乙醇、原料粒度32目、液料比為20∶1、提取時(shí)間為2 h。提取溫度選取50、60、70、80和90℃，考察其對(duì)提取得率的影響。

1.5.5 液料比對(duì)提取得率的影響

控制回流條件:提取溶劑為無(wú)水乙醇、原料粒度32目、回流溫度80℃、提取時(shí)間2h。液料比選取5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1，考察其對(duì)提取得率的影響。

1.6 響應(yīng)面法優(yōu)化設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)采用Design expert8.0軟件中的Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取提取時(shí)間、提取溫度和液料比3個(gè)因素作為試驗(yàn)因素，以5-羥色胺衍生物提取得率為響應(yīng)值設(shè)計(jì)試驗(yàn)，試驗(yàn)因素及水平見表1。

表1 紅花籽粕5-羥色胺衍生物提取響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of experimental response surface methodology

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 提取溶劑對(duì)5-羥色胺衍生物提取得率的影響

圖1 不同提取溶劑對(duì)5-羥色胺衍生物提取得率的影響Fig.1 Effects of extraction solvent type on 5-hydroxytryptamine derivatives

從圖1可以看出，不同提取溶劑對(duì)紅花籽粕中5-羥色胺衍生物提取得率影響較大。乙酸乙酯和甲醇的提取效果最好，無(wú)水乙醇的提取效果差一些。但無(wú)水乙醇安全、無(wú)毒，而且價(jià)格便宜、來(lái)源廣泛，適合工業(yè)化操作。因此，選取無(wú)水乙醇作為提取溶劑。

2.1.2 原料粒度對(duì)5-羥色胺衍生物提取得率的影響

圖2 原料粒度對(duì)5-羥色胺衍生物提取得率的影響Fig.2 Effects of size of material on 5-hydroxytryptamine derivatives

圖5 液料比對(duì)5-羥色胺衍生物提取得率的影響Fig.5 Effects of liquid-to-solid ratio on 5-hydroxytryptamine derivatives

從圖2可以看出，原料粒度小于32目時(shí)，原料粒度對(duì)提取效果的影響非常大。原料的粒度大于32目時(shí)，原料粒度的升高對(duì)提取得率沒(méi)有影響?？紤]到原料進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的粉碎會(huì)增加了操作成本，而且從圖1看，高于32目的粒度是沒(méi)必要的，確定32目為最佳原料粒度。

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)5-羥色胺衍生物提取得率的影響

由圖3可知，提取時(shí)間對(duì)提取率有較大影響，隨著提取時(shí)間的增加，5-羥色胺衍生物提取得率呈增長(zhǎng)的趨勢(shì)，在2.0 h之后增長(zhǎng)趨勢(shì)減緩，考慮到提取周期，選取1.5、2、2.5 h 進(jìn)行中心組合試驗(yàn)。

2.1.4 提取溫度對(duì)5-羥色胺衍生物提取得率的影響

由圖4可知，5-羥色胺衍生物提取得率隨溫度升高而增加，在80℃之后，增長(zhǎng)趨勢(shì)減緩，故選取提取70、80、90℃進(jìn)行中心組合試驗(yàn)。

2.1.5 液料比對(duì)5-羥色胺衍生物提取得率的影響

由圖5可知，隨著液料比增加，5-羥色胺衍生物提取得率有所增加，在料液比15∶1之后，得率隨著用液量增加趨勢(shì)明顯減緩，考慮節(jié)約成本，選取液料比10∶1、15∶1、20∶1 進(jìn)行中心組合試驗(yàn)。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化紅花籽粕5-羥色胺衍生物提取工藝

2.2.1 模型方差分析

對(duì)紅花籽粕5-羥色胺衍生物提取工藝進(jìn)行響應(yīng)面分析，其具體試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。

表2 5-羥色胺衍生物提取工藝條件的優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Optimization of extraction conditions and results of experimental design

采用Design-Expert8.0軟件對(duì)各因素回歸擬合，得回歸方程:5-羥色胺衍生物提取得率=0.53+0.04X1+0.035X2+0.031X3-0.7344 × 10-3X1X2-4.403 ×10-3X1X3-0.013X2X3-9.187 ×10-3♂ -0. 015♂

表3 方差分析結(jié)果Table 3 ANOVA of regression analysis

由表3可知，回歸模型(P＜0.0001)極顯著，相關(guān)系數(shù) R2=0.9874，失擬項(xiàng)(P=0.5137 ＞0.05)影響不顯著，表明該模型擬合度很好，因此，可以用該回歸模型對(duì)實(shí)驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行分析?；貧w模型方差分析的結(jié)果表明:X1、X2、X3、X2X3、X3X3(P ＜0.01)為極顯著項(xiàng);X1X2、X1X1(P ＜0.05)為顯著項(xiàng);其余項(xiàng)不顯著。通過(guò)F值得出:提取時(shí)間(X1)對(duì)5-羥色胺衍生物提取得率影響最顯著，其次是提取溫度(X2)，液料比(X3)的影響相對(duì)較少。

2.2.2 響應(yīng)面分析

提取時(shí)間(X1)、提取溫度(X2)、液料比(X3)3個(gè)因素之間的交互作用對(duì)5-羥色胺衍生物提取得率的影響如圖6所示。其中，提取溫度與液料比(X2X3)之間的交互作用極顯著，隨著溫度和液料比的增加，5-羥色胺衍生物提取得率達(dá)到最大;提取時(shí)間與提取溫度(X1X2)之間的交互作用顯著;提取時(shí)間與液料比(X1X3)之間的交互作用不顯著。

依據(jù)所得模型，可預(yù)測(cè)穩(wěn)定狀態(tài)下紅花籽粕5-羥色胺衍生物的提取最優(yōu)工藝:提取溶劑為無(wú)水乙醇、原料粒度為32目、提取時(shí)間為2.4 h、提取溫度為89℃、液料比為19∶1。紅花籽粕5-羥色胺衍生物的提取得率可達(dá)0.34%。

2.3 工藝驗(yàn)證

為了驗(yàn)證該響應(yīng)面分析法結(jié)果的可靠性，按上述最佳工藝(提取時(shí)間為2.4 h、提取溫度89℃、液料比19∶1)進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，實(shí)際測(cè)得5-羥色胺衍生物提取得率的平均值為0.33%。表明預(yù)測(cè)值(0.34%)與實(shí)際值(0.33%)之間具有很好的擬合性，從而進(jìn)一步證明優(yōu)化結(jié)果的可靠性。

3 結(jié)論

本文在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析法對(duì)紅花籽粕5-羥色胺衍生物提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，得出最佳提取工藝:提取溶劑為無(wú)水乙醇、原料粒度為32目、提取時(shí)間為2.4 h、提取溫度為89℃、液料比為19∶1?；貧w分析和驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，采用響應(yīng)面法優(yōu)化紅花籽粕5-羥色胺衍生物的提取工藝條件，得到的提取工藝流程具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

圖4 因素間交互作用的響應(yīng)曲面和等高線圖Fig.4 Response surface and contour plots between factors

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