強(qiáng)直性脊柱炎患者外周血TCR Vα CDR3譜系基因掃描分析研究①

魏克娜 余伍忠 徐新玉 張 璐 鄒紅云

(蘭州軍區(qū)烏魯木齊總醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所，烏魯木齊830000)

強(qiáng)直性脊柱炎(Ankylosing spondylitis，AS)是一種以骶髂關(guān)節(jié)和脊柱等中軸關(guān)節(jié)附著點(diǎn)炎癥為主的自身免疫病，其發(fā)生與遺傳、慢性感染、自身免疫功能紊亂等多種因素有關(guān)。遺傳因素(尤其是人類白細(xì)胞抗原B27(Human leucocyte antigen B27，HLAB27))致病機(jī)理的研究一直是AS的研究焦點(diǎn)，但其確切病因和發(fā)病機(jī)制至今尚未完全明確。

近年來(lái)，T淋巴細(xì)胞在AS致病中的作用機(jī)制引起廣泛關(guān)注。免疫組化研究發(fā)現(xiàn)［1，2］，AS患者病變的骶髂關(guān)節(jié)及滑膜組織活檢標(biāo)本中，出現(xiàn)大量炎性T細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，這些炎性T細(xì)胞參與了AS的發(fā)病過(guò)程，有可能是AS發(fā)病中的特定的反應(yīng)性T細(xì)胞。目前，對(duì)AS相關(guān)免疫活性T細(xì)胞的研究報(bào)道十分有限。

T淋巴細(xì)胞通過(guò)T細(xì)胞受體(T cell receptor，TCR)的可變區(qū)(Variale，V區(qū))識(shí)別外來(lái)抗原，抗原首先要被抗原遞呈細(xì)胞處理為9～14個(gè)氨基酸的多肽(抗原肽)，這些抗原肽和MHC分子一同在抗原遞呈細(xì)胞分子表面表達(dá)，TCR分子識(shí)別并結(jié)合的是MHC肽復(fù)合物，從而引起一連串的免疫反應(yīng)。TCR基因重排過(guò)程中，TCR α鏈的V區(qū)和結(jié)合區(qū)(Joint，J區(qū))之間可存在不同數(shù)量的堿基對(duì)，稱為N區(qū)，V區(qū)和J區(qū)結(jié)合的多樣化和N區(qū)不同數(shù)量核苷酸的隨機(jī)插入形成的高度可變區(qū)(VNJ區(qū))，稱為互補(bǔ)決定區(qū)3(Complementarity determining region 3，CDR3)，是TCR直接與抗原決定簇結(jié)合的部位，具有多態(tài)性。CDR3區(qū)的結(jié)構(gòu)對(duì)于MHC抗原特異性識(shí)別至關(guān)重要，不同重排時(shí)CDR3長(zhǎng)度不同，通過(guò)檢測(cè)不同亞家族CDR3長(zhǎng)度，可以了解TCR不同亞家族的克隆性特點(diǎn)［3］。近年來(lái)，T細(xì)胞TCR CDR3免疫掃描譜系分析技術(shù)廣泛應(yīng)用于自身免疫病的研究，但目前受到較多關(guān)注的是T細(xì)胞TCR Vβ CDR3譜系的多態(tài)性［4］，而 TCR Vα 譜系特點(diǎn)的研究報(bào)道較少［5］，本研究采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和基因掃描技術(shù)來(lái)分析AS患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood monouclear cell，PBMC)中34個(gè) TCR Vα亞家族的基因表達(dá)及其克隆增生情況，了解患者的細(xì)胞免疫功能，為探索T細(xì)胞在AS免疫發(fā)病中的作用機(jī)制提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 病例選擇 10例AS患者，男性8例，女性2例，其中HLA-B27陽(yáng)性9例，HLA-B27陰性1例，均來(lái)自蘭州軍區(qū)烏魯木齊總醫(yī)院門診和住院患者，均為初診、未經(jīng)治療，或者停藥后復(fù)發(fā)尚未經(jīng)再次治療的患者，年齡為17～42歲，均符合紐約1984年修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)［6］，并排除其他自身免疫性疾病和感染性疾病。5例正常健康人對(duì)照及所有入選病例均采集乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝靜脈血5 ml，取血前均征得本人及家屬同意。

1．2 RNA提取和cDNA合成 按RNA提取試劑盒(Omega Bio-Tek，美國(guó))提取10例AS患者和5例正常健康人PBMC(2×106細(xì)胞)中的RNA，按照cDNA Kit條件，用Olig dT作引物擴(kuò)增cDNA(每樣本合成3個(gè)反應(yīng)體系)。

1．3 TCR Vα和TCR Cα家族引物設(shè)計(jì)和合成 參照文獻(xiàn)［5，7］，合成TCR Vα亞家族上游引物34條;TCR Cα下游引物1條(內(nèi)側(cè)端帶FAM熒光標(biāo)記)，TCR Cα對(duì)照引物兩條，引物均由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。

1．4 PCR擴(kuò)增34個(gè)TCR Vα亞家族 PCR反應(yīng)體積為 50 μl，含 cDNA 模板 2 μl，dNTP(2．5 mmol/L)4 μl，10 ×PCR Buffer(含 Mg2+)5 μl，TCR Vα 上游引物2 μl，下游共用TCR Vα引物(內(nèi)側(cè)端帶FAM熒光標(biāo)記)2 μl(所有上、下游引物濃度均為10 μmol/L)，Taq DNA多聚酶1．25 U。反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性5分鐘;95℃ 30秒，60℃ 30秒，72℃ 90秒，35個(gè)循環(huán);72℃延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠(溴乙錠染色)中進(jìn)行電泳，余－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．5 基因掃描分析(CDR3長(zhǎng)度分析)T細(xì)胞克隆

取TCR Vα各家族帶FAM熒光標(biāo)記的PCR產(chǎn)物2 μl，加入去離子甲酰胺(Hi-Di Formamide，美國(guó)ABI公司)2 μl，0．5 μl標(biāo)準(zhǔn)品(美國(guó) ABI公司，Genescan 500-Tamra，其中含有不同大小的熒光素Tamra標(biāo)記的 DNA片段)及 0．5 μl上樣緩沖液(25 mmol/L EDTA，50 mg/ml blue dextran)，94℃變性4分鐘后，每管取2 μl于6%變性聚丙酰胺凝膠中電泳2小時(shí)，并用373A DNA序列分析儀(ABI，Perkin Elmer公司)分析結(jié)果，通過(guò)分析軟件GeneS-can672、激光掃描及計(jì)算機(jī)收集電泳過(guò)程中不同時(shí)間所出現(xiàn)的不同顏色和強(qiáng)度的熒光素而顯示出不同位置、高度、顏色和形態(tài)的峰。

圖1 正常健康人34個(gè)TCR Vα亞家族和TCR Cα對(duì)照RT-PCR產(chǎn)物2%瓊脂糖凝膠電泳圖Fig．1 2%agarose gel electrophoresis of the RT-PCR products of 34 TCR Vα subfamilies and TCR Cα in a normal control

2 結(jié)果

2．1 PBMC TCR Vα 34亞家族RT-PCR結(jié)果 正常健康人及AS患者的PBMC 34個(gè)TCR Vα亞家族及TCR Cα對(duì)照均有表達(dá)，RT-PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠電泳圖上預(yù)測(cè)相應(yīng)大小處顯示特異性的條帶(見(jiàn)圖1)。

圖2 正常健康人PBMC TCR Vα 34個(gè)亞家族CDR3譜型基因掃描分析圖Fig．2 Spectratyping of CDR3 sizes for all 34 TCR Vα gene subfamilies in PBMC in a normal control

數(shù)患者中的掃描譜型呈單峰即單克隆增生，其中Vα19亞家族在3例患者中的掃描譜型均呈單峰，即單克隆增生;Vα32、Vα7 及 Vα1．2分別在2 例患者中出現(xiàn)單峰;僅在1例患者中呈現(xiàn)單峰的亞家族有:Vα31(1號(hào)患者)、Vα4．1 和 Vα9(3 號(hào)患者)、Vα8和Vα24(5 號(hào)患者)、Vα20 和 Vα28(6 號(hào)患者)、Vα30(7號(hào)患者)及Vα17(8號(hào)患者);寡峰/寡峰趨勢(shì)出現(xiàn)頻率較高的亞家族為 Vα5和 Vα13(均為50%，5/10);偏峰出現(xiàn)頻率較高的亞家族為Vα18(為30%，3/10);不規(guī)則異常峰型出現(xiàn)頻率較高的

表1 不同AS患者TCR Vα亞家族的異常峰型率Tab．1 The abnormal peak rate of TCR Vα subfamilies in different AS patients

圖3 AS患者34個(gè)TCR Vα亞家族的異常峰型率Fig．3 Abnormal peak rate for all 34 TCR Vα subfamilies in AS patients

圖4 部分AS患者TCR Vα亞家族RT-PCR產(chǎn)物基因掃描分析結(jié)果Fig．4 Analyse results of RT-TCR gene scanning for TCR Vα subfamilies in part of AS patients

2．2 TCR Vα亞家族基因掃描分析結(jié)果 基因掃描分析結(jié)果顯示:5例正常健康人PBMC TCR Vα絕大多數(shù)亞家族譜型呈現(xiàn)8～10個(gè)中間高、兩端低的鐘型峰圖，即呈正態(tài)分布或高斯分布(見(jiàn)圖2)。

所有AS患者外周血T細(xì)胞均出現(xiàn)多個(gè)TCR Vα家族譜型的異常改變，異常峰型包括:單峰、寡峰/寡峰趨勢(shì)、偏峰及不規(guī)則異常峰型。不同患者的TCR Vα亞家族的異常峰型率在35%(12/34)～68%(23/34)。其中HLA-B27陰性的1號(hào)患者，其TCR Vα亞家族異常峰型率為60%(19/34)，見(jiàn)表1。

34個(gè)TCR Vα亞家族中，不同亞家族出現(xiàn)異常峰型的頻率不同，其中TCR Vα15在全部患者中均出現(xiàn)異常峰型(異常峰型率為100%，10/10);其他亞家族中異常峰型率較高的有:Vα13和Vα18均為90%(9/10)，Vα3、Vα5、Vα6、Vα12 和 Vα16 均為80%(8/10)，而 Vα1．1、Vα17、Vα21 和 Vα25 亞家族異常峰型出現(xiàn)頻率較低，為30%(3/10)。見(jiàn)圖3。

34個(gè)TCR Vα亞家族中，共有17個(gè)亞家族在少亞家族也是Vα18(為50%，5/10)?；颊卟糠諸CR Vα亞家族的不同峰型掃描圖見(jiàn)圖4。

3 討論

隨著AS發(fā)病率的增高，其發(fā)病機(jī)制越來(lái)越得到廣泛的關(guān)注。關(guān)于TCR CDR3的監(jiān)測(cè)與分析有多種方法:定量PCR、PCR-DNA印跡(Southern blot)、PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性(Single strand conformation polymorphism，SSCP)和DNA-異源雙鏈追蹤分析(Heteroduplex tracking assay，HTA)等方法來(lái)判斷T細(xì)胞可變區(qū)的變化。近年來(lái)，采用RT-PCR-免疫掃描譜型分析-測(cè)序技術(shù)分析TCR CDR3的表達(dá)頻率和長(zhǎng)度分布(即譜系漂移)已成為目前最為靈敏、精確的檢測(cè)T淋巴細(xì)胞克隆的方法，成為很有前景的研究方向。相比其他檢測(cè)方法，RT-PCR-免疫掃描譜型分析-測(cè)序技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)有:檢測(cè)除了能在樣本中找到單/寡克隆增生的T細(xì)胞，并提供T細(xì)胞應(yīng)答庫(kù)的組成信息(不同的亞家族出現(xiàn)異常峰型或表達(dá)頻率的變化);不需要對(duì)樣本進(jìn)行其他特殊處理;能區(qū)分多基因V家族成員;經(jīng)自動(dòng)分析獲得的直觀圖有利于去除混雜背景，具有特異性特點(diǎn)，適于處理大量標(biāo)本。并且，此技術(shù)既可以作為一種定性、快速的篩選方法，也可以用于定量分析。本研究為該技術(shù)的進(jìn)一步推廣應(yīng)用提供了更多的資料。

自身免疫病的中心環(huán)節(jié)是體內(nèi)存在針對(duì)性自身抗體，其基礎(chǔ)是自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞對(duì)特異性抗原的識(shí)別和激活。正常情況下，機(jī)體未受任何抗原刺激時(shí)，外周血T細(xì)胞TCR Vα重排是隨機(jī)的，T細(xì)胞表現(xiàn)為多克隆性;疾病狀態(tài)下，特殊的抗原刺激可引起某一個(gè)或幾個(gè)亞家族的TCR針對(duì)性重排，出現(xiàn)異常克隆性增生［8-10］，T細(xì)胞的選擇性擴(kuò)增表明該淋巴細(xì)胞是特異性的，受抗原的激發(fā)而產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，它們被認(rèn)為是致病性 T細(xì)胞［11，12］。

TCR Vα基因由于不含有高變區(qū)(Diversity，D區(qū))，故僅有V區(qū)和J區(qū)發(fā)生重排［13］。有研究表明，TCR α鏈比TCR β鏈多樣性更多，識(shí)別抗原肽主要依靠 TCR α 鏈［14，15］。由于 TCR α 鏈和 TCR β 鏈?zhǔn)且援愒炊垠w表達(dá)于T細(xì)胞表面的，為了全面了解特異識(shí)別抗原的TCR，需要同時(shí)了解TCR Vα和TCR Vβ亞家族的優(yōu)勢(shì)取用情況。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，AS患者TCR Vβ CDR3掃描譜型具有顯著多態(tài)性特點(diǎn)［16］，在此基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步分析了AS患者TCR Vα亞家族的克隆性分布情況及特點(diǎn)，以期全面了解AS患者TCR CDR3譜系的多態(tài)性特點(diǎn)。目前有關(guān)AS患者 TCR Vα CDR3譜系及克隆性的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

TCR Vα亞家族的表達(dá)和克隆性分析方法與TCR Vβ亞家族相同，只是選用的亞家族特異性引物不同。本研究對(duì)10例AS患者TCR Vα亞家族的CDR3譜系和克隆性表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，所有AS患者外周血T淋巴細(xì)胞均出現(xiàn)多個(gè)TCR Vα家族譜型的異常改變，進(jìn)一步表明AS患者T細(xì)胞存在異常。AS患者部分亞家族出現(xiàn)單克隆或寡克隆/寡克隆趨勢(shì)增生的表達(dá)情況，以及不同患者不同家族呈現(xiàn)優(yōu)勢(shì)增生，提示在某些因素的作用下，患者體內(nèi)的自身免疫平衡已被打破，可能產(chǎn)生了針對(duì)自身的T淋巴細(xì)胞;亦有可能是特定抗原刺激所引起的一種特異性免疫應(yīng)答;或者是自身免疫紊亂而產(chǎn)生的多樣單/寡克隆增生的T細(xì)胞。不同患者出現(xiàn)不同數(shù)量亞家族(4～11個(gè)TCR Vα亞家族)寡克隆/寡克隆趨勢(shì)增生性T細(xì)胞，可能與不同患者其免疫狀態(tài)、疾病病程及嚴(yán)重程度不同等因素有關(guān)，還有待于進(jìn)一步探究;各TCR Vα亞家族在不同患者中表現(xiàn)的異常峰型亦有所不同，因病例數(shù)有限，尚未見(jiàn)有明顯的規(guī)律性。不同的患者單/寡克隆性T細(xì)胞TCR Vα亞家族的個(gè)體特異性可能與不同個(gè)體的HLA-B27亞型或其他HLA遺傳背景的差異性以及與抗原的多樣性有關(guān)。目前對(duì)克隆性增生的T細(xì)胞在體內(nèi)的功能意義值得進(jìn)一步研究。

研究結(jié)果還顯示，HLA-B27陰性的1號(hào)患者出現(xiàn)與其他HLA-B27陽(yáng)性患者類似的異常峰型，且異常峰型率差別不大，但由于病例數(shù)較少，HLA-B27是否與AS患者TCR Vα亞家族異常峰型率有關(guān)還有待于進(jìn)一步確證。

本研究發(fā)現(xiàn)了部分單克隆和寡克隆增生的TCR Vα亞家族，T淋巴細(xì)胞單/寡克隆性增生是疾病的病因，還是由該病造成的結(jié)果，我們將進(jìn)一步在增加樣本量的基礎(chǔ)上，對(duì)這種單/寡克隆增生的亞家族CDR3進(jìn)行基因序列及氨基酸序列分析，探討是否存在有CDR3共同基序，再進(jìn)一步結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù)，篩選出與AS高度相關(guān)的克隆性增生家族，還有必要結(jié)合病情跟蹤監(jiān)測(cè)患者在不同時(shí)期TCR CDR3譜系的變化。為發(fā)現(xiàn)AS相關(guān)特異性抗原提供線索，并為以T細(xì)胞為靶點(diǎn)的特異性免疫治療提供新的理論依據(jù)。TCR CDR3譜系克隆性特點(diǎn)與疾病的發(fā)病機(jī)制的具體關(guān)系是怎樣的有待于進(jìn)一步研究。

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